马彦娟，牛丽丹，张建新，吴 畏，孔令宇，蔡君艳，石金河

(新乡医学院第一附属医院急诊科，卫辉 453100)

急性胰腺炎(AP)是胰腺的突发性炎症过程，是由多种病因导致胰腺内胰酶被激活从而引发胰腺组织自身的炎症反应[1-2]，其发病机制复杂，涉及多种因素，包括活化的胰酶、细胞因子和趋化因子等[3]。转化生长因子β1(TGF-β1)参与调节细胞增殖、分化、凋亡和免疫反应等多种生物学过程[4]。研究显示，AP患者及AP模型动物的TGF-β1信号通路表达均上调[5-7]。动物实验显示，在AP模型大鼠血清中miRNA-216a mRNA的表达显著升高[8-9]。

课题组前期研究结果显示，地塞米松(DEX)对AP模型胰腺中的Notch信号通路有一定程度的影响[10]，对其他信号通路，如TGF-β1/Smad/细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)信号通路及miRNA-216a mRNA的影响还未见报道。本研究利用蛙皮素建立小鼠AP模型，进一步探索DEX对胰腺腺泡细胞保护的作用机制。

1 仪器与材料

1.1仪器 全自动生化检测仪(日本株式会社日立制作所)；LightCycler LC480 Real-Time PCR system(瑞士罗氏公司)；Bio-Rad SDS-PAGE型电泳分离仪(美国伯乐生命医学产品有限公司)；ODYSSEY型双色红外激光成像系统(美国LI-COR Biosciences公司)。

1.2试药 兔抗TGF-β1抗体(货号：ab92486)，兔抗P-Smad3抗体(货号：ab40854)，Smad7抗体(货号：ab216428)，兔抗磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶1/细胞外信号调节蛋白激酶2(P-ERK/ERK2)抗体(货号：ab17942)，均购自美国Abcam公司；兔抗GAPDH抗体，美国Sigma公司；RT-qPCR试剂盒，均购自北京全式金生物技术有限公司。淀粉酶(AMY)与脂肪酶(LPS)检测试剂盒，购于南京建成生物研究所；DEX(批号20140629)，天津金耀药业有限公司;蛙皮素(批号60321ES03)，上海翊圣生物科技有限公司。

1.3动物 清洁级健康雄性C57BL/6J小鼠60只，购于新乡医学院实验动物中心，体质量为25～30 g，实验过程经实验动物福利委员会许可，动物使用许可证号：SYXK(豫) 2011-0001。

2 方法

2.1造模 将小鼠随机分为对照组(10只)、AP组(25只)和DEX组(25只)。造模过程参照杨飞云等[11]实验方法，将蛙皮素溶于生理盐水中制成质量浓度为10 μg·mL-1的溶液，AP组小鼠用蛙皮素腹腔注射，剂量为50 μg·kg-1，连续注射3次，每次间隔2 h；DEX组在每次注射蛙皮素后腹腔注射质量浓度为5 μg·mL-1的DEX，1 mL·kg-1；对照组连续3次注射生理盐水。所有小鼠均在最后1次注射后2 h处死，采集各组小鼠的血液及胰腺组织。

2.2血清中AMY和LPS的水平测定 将小鼠血液以3 000 r·min-1离心10 min，取上清液，按照试剂盒说明书操作，通过速率法对AMY和LPS的水平进行检测。

2.3血清促炎因子白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6 (IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和TGF-β1水平测定 将小鼠血液以3 000 r·min-1离心10 min，取上清液，采用Elisa法测定各组胰腺组织和血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和TGF-β1的水平。

2.4胰腺组织中miRNA-216a mRNA表达的测定 利用RT-qPCR法检测胰腺组织中miRNA-216a mRNA的表达。将各组小鼠的胰腺组织分别研成粉末状后，置于1.5 mL Ep管中，加入适量的Trizol 试剂提取总RNA，按照逆转录试剂盒的说明书将RNA逆转录成cDNA。引物序列由上海生工设计并合成(miRNA-216a上游引物5′-TAATCTCAGCTGGCAACTGTGA-3′，下游引物5′-TCACAGTTGCCAGCTGAGATTA-3′；内参GAPDH上游引物5′-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3′，下游引物5′-TGGTCCAGGGTTTCTACTCC-3′)。以cDNA为模板进行扩增，RT-qPCR反应条件:预变性94 ℃ 30 s，变性94 ℃ 5 s、退火60 ℃ 30 s、延伸72 ℃ 30 s，共40个循环。

2.5胰腺组织中TGF-β1、Smad7、P-Smad3和P-ERK1/ERK2的蛋白表达 利用Western Blot 法检测各组小鼠胰腺组织中TGF-β1、Smad7、P-Smad3和P-ERK1/ERK2的蛋白表达情况。将各组小鼠胰腺组织分别研成粉末状后移至1.5 mL Ep管中，加入适量的RIPA裂解液，离心，取上清液，利用BCA试剂盒测定蛋白浓度。利用Bio-Rad SDS-PAGE电泳分离蛋白后移至NC膜，分别加Ⅰ抗4 ℃孵育过夜，Ⅰ抗稀释使用浓度分别为TGF-β1抗体(1∶1 000)、Smad7抗体(1∶1 000)、P-Smad3抗体(1∶500)、P-ERK1/ERK2抗体(1∶500)、GAPDH抗体(1∶10 000)，加荧光Ⅱ抗室温孵育2 h后，利用ODYSSEY双色红外激光成像系统曝光，采集图像分析灰度值。

3 结果

3.1血清中AMY与LPS水平变化 见表1。由表1可知，与对照组比较，AP组血清中AMY与LPS水平均显著升高(P<0.01)；与AP组比较，DEX组血清中二者的水平均显著降低(P<0.05)。

表1 3组小鼠血清中AMY和LPS水平的比较

3.2小鼠胰腺组织及血清中TNF-α、IL-6、IL-1β和TGF-β1水平 结果见表2和表3。由表2和表3可知，与对照组比较，AP组小鼠胰腺组织与血清中TNF-α、IL-6、IL-1β和TGF-β1水平均显著升高(P<0.01)；与AP组比较，DEX组小鼠胰腺组织与血清中TNF-α、IL-6、IL-1β和TGF-β1水平均显著降低(P<0.05)。

表2 3组小鼠胰腺组织中TNF-α、IL-6、IL-1β和TGF-β1水平比较

表3 3组小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β和TGF-β1水平比较

3.3小鼠胰腺组织中miRNA-216a mRNA的表达结果 与对照组比较，AP组小鼠胰腺组织中miRNA-216a mRNA的表达显著升高(2.787±0.422)，差异有统计学意义(P<0.001)；与AP组比较，DEX组小鼠胰腺组织中miRNA-216a mRNA的表达显著降低(2.315±0.239)，差异有统计学意义(P<0.05)。

3.4各组小鼠胰腺组织中TGF-β1、P-Smad3、Smad7和P-ERK1/ERK2的蛋白表达结果 见图1和表4。

表4 TGF-β1、P-Smad3、Smad7和P-ERK1/ERK2蛋白在小鼠胰腺组织中的表达

由图1和表4可知，与对照组比较，AP组小鼠胰腺组织中TGF-β1、P-Smad3和P-ERK1/ERK2的蛋白表达显著升高，差异均有统计学意义(P<0.01)，而Smad7的蛋白表达显著降低(P<0.001)；与AP组比较，DEX组小鼠胰腺组织中TGF-β1、P-Smad3和P-ERK1/ERK2的蛋白表达显著降低(P<0.05)，而Smad7的蛋白表达显著升高(P<0.01)。

图1 TGF-β1、P-Smad3、Smad7和P-ERK1/ERK2蛋白在胰腺组织中的表达

4 讨论

AP的发生发展是一个复杂的过程，涉及众多因素，包括活化的胰酶、细胞因子和趋化因子等[3]。转化生长因子β(TGF-β)信号通路参与多种生理病理过程，在组织细胞的生长、发育、增殖和分化中起关键作用，对免疫功能、炎症反应等具有重要的调节作用。TGF-β有3种亚型，即TGF-β1、转化生长因子β2(TGF-β2)和转化生长因子β3(TGF-β3)。研究显示，在AP模型中，TGF-β1的表达升高，其参与AP的病理过程，抑制其可减轻AP的严重程度[6，12-14]。激活的TGF-β1，可被下游的Smad2和Smad3蛋白识别，将信号传递给细胞信号转导分子Smad4，最终上调Smad7的转录活性[15]。李永涛等[16]研究显示，AP患者胰腺组织中TGF-β1、TNF-α和IL-6等水平均显著升高，参与AP的病理过程。

miRNA作为一种非编码的RNA，在免疫应答和炎症反应过程中，其可通过调控靶基因的表达而发挥重要的作用[17]。在AP模型大鼠血浆中miRNA-216a mRNA的表达显著升高，参与AP的病理过程，可作为AP诊断的潜在生物标志[9，18-19]。

DEX是一种皮质类固醇，具有抗炎和改善微循环的作用，临床上应用其治疗AP[20-21]。前期研究结果显示，DEX对AP模型动物胰腺中的Notch信号通路及NK-κB信号通路均有一定程度的影响[10-11]，它对其他信号通路，如TGF-β1/Smad/ERK信号通路及miRNA-216a mRNA表达的影响尚未见报道。

本研究结果显示，AP组大鼠胰腺组织中miRNA-216a mRNA的表达显著高于对照组，这与以往研究结果一致，与AP组比较，使用DEX治疗后，动物胰腺组织中miRNA-216a mRNA的表达显著降低，说明DEX可降低AP动物胰腺组织中miRNA-216a mRNA的表达。

本文研究了AP中DEX对TGF-β信号通路的影响，初步阐明了DEX治疗AP的作用机制。使用DEX治疗后，TGF-β信号通路中TGF-β1、P-Smad3及P-ERK1/ERK2的蛋白表达显著降低，而Smad7的蛋白表达显著升高。同时，使用DEX治疗后，动物胰腺组织与血清中的TNF-α、IL-6及IL-1β、TGF-β1的水平均显著降低，结果提示，AP发生时，DEX可通过抑制TGF-β1的水平，抑制Smad3蛋白的磷酸化，进而抑制ERK1/ERK2蛋白的磷酸化，同时促进Smad7的表达，从而抑制TGF-β1/Smad/ERK信号通路的激活；AP过程中，参与炎症反应的炎症细胞因子主要有IL-1β、TNF-α、IL-6与TGF-β1等，本研究中DEX通过抑制TGF-β1/Smad/ERK信号通路的激活，减少炎症因子的合成与释放，减轻对胰腺腺泡细胞的损伤。

Zhang J等[6]研究表明，TGF-β可调节miRNA-216a，抑制TGF-β后可抑制miRNA-216a mRNA的表达，DEX是否可通过抑制TGF-β信号通路而抑制miRNA-216a，有待进一步研究，下一步将通过细胞实验研究DEX的作用机制，为临床治疗AP提供参考。