孙怀艳，杨晓丹，张梦翔，程耀堂

(1.安徽中医药大学第二附属医院药剂科，合肥 230061；2.安徽中医药大学第三附属医院药剂科，合肥 230061)

脑动脉硬化(CEA)是由于脑血流量减少发生的弥漫性动脉硬化，常发于中老年人，主要表现为神经衰弱、颈动脉粥样硬化(AS)和眼底动脉硬化[1]。临床主要采用降血脂药物、扩张血管药物、介入治疗和对症治疗等治疗CEA，但仍存在部分患者治疗效果并不理想[2]。研究显示[3]，CEA的发病机制可能与血管内皮损伤、脂质代谢障碍和高血压等密切相关。三七皂苷R1(NR1)是从三七的根及根茎中提取的有效活性成分，具有止血定痛、活血化瘀的功效[4]以及抗炎、抗氧化、降血脂、降血压等药理学作用，可抑制AS的形成[5]。本研究探索了NR1对CEA大鼠脑组织损伤和血管内皮细胞(VEC)功能的影响及可能的机制，以期指导临床治疗CEA。

1 仪器与材料

1.1仪器 HX-Ⅱ型小动物血压测量计，北京明信通生物科技有限公司；7600型全自动生化分析仪，日本HITACHI公司。

1.2试药 三七皂苷R1(NR1)对照品，上海源叶生物科技有限公司；辛伐他汀(批号A19042301)，浙江京新药业有限公司；内皮素-1(ET-1)检测试剂盒，上海晶抗生物工程有限公司；一氧化氮(NO)检测试剂盒，南京建成生物工程研究所；辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔二抗，丹麦DAKO公司；兔抗鼠P-p38MAPK、p38MAPK、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)抗体，均购自美国Santa Cruz公司。

1.3动物 雄性SPF级SD大鼠65只，体质量为(200±20) g，由安徽实验动物中心提供，饲养于安徽中医药大学动物中心实验室，室温控制在25 ℃，所有大鼠均自由饮食饮水。

2 方法

2.1造模及给药 所有大鼠预饲养1周后，随机选取10只作为对照组，剩余55只大鼠采用双肾双夹法复制肾性高血压CEA模型[6]，先行双侧肾主动脉狭窄手术复制肾性高血压模型，术后1周给予高脂乳剂10 mL·kg-1，每日1次，连续灌胃14周，制备CEA模型，造模后大鼠出现血压、血脂升高，且脑中动脉出现动脉硬化斑块为造模成功，共50只大鼠造模成功；对照组只行双侧肾动脉分离术，饲喂常规饲料。将造模成功的大鼠随机分为模型组、NR1高、中、低剂量组和辛伐他汀组，各10只。造模后NR1高、中、低剂量组分别灌胃NR1 100、50、25 mg·kg-1·d-1，每日1次；辛伐他汀组灌胃辛伐他汀2.5 mg·kg-1·d-1，连续给药4周；模型组和对照组大鼠均灌胃等体积生理盐水。

2.2各组大鼠血清相关指标的检测 治疗后，采用小动物血压测量仪通过套尾法测定收缩压(SBP)、舒张压(DBP)和平均动脉压(MAP)。分离腹主动脉血液，以3 500 r·min-1离心10 min，采用生化分析仪检测血清胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)及低密度脂蛋白(LDL-C)的水平。

2.3HE染色观察脑中动脉组织的病理变化 处死大鼠，迅速分离大鼠脑中动脉，用生理盐水冲洗后，加入质量浓度为40 g·L-1的多聚甲醛进行固定，常规脱水、透明、包埋、切片、HE染色，在光学显微镜下观察大鼠脑组织的病理变化，每张切片随机取5个视野拍照。

2.4脑组织NO和ET-1水平检测 取大鼠脑皮质及海马组织，匀浆，参考试剂盒说明书采用硝酸还原酶法测定脑组织中NO水平，参考试剂盒说明书采用放射免疫直接测定法检测脑组织中ET-1水平。

2.5Western Blot法测定脑组织中p38MAPK信号通路蛋白的表达 取大鼠脑皮质及海马组织，匀浆，加入1 mL细胞裂解液，以12 000 r·min-1离心5 min，取上清液，置于-20 ℃冰箱中保存，采用二喹啉甲酸试剂盒进行蛋白定量，取50 μg提取的总蛋白样品经SDS-PAGE凝胶电泳，采用湿转法转膜至硝酸纤维素膜，加质量浓度为50 g·L-1的脱脂牛奶封闭2 h，采用洗膜缓冲液(TBST)洗膜30 min，加入一抗p38MAPK、P-p38MAPK、eNOS、iNOS(1∶500)，以β-actin(1∶500)为内参，于4 ℃下孵育过夜，TBST洗膜30 min，并加HRP标记的二抗(1∶1 000)，37 ℃下孵育2 h，采用电化学发光显影，采用Image J图像分析系统分析蛋白相对表达量。

3 结果

3.1NR1对CEA大鼠脑中动脉损伤的影响 见图1。由图1可知，对照组大鼠脑中动脉组织细胞排列整齐，结构完整，未见明显病变；模型组和NR1低剂量组大鼠脑中动脉壁明显增厚，内皮细胞向管腔内突出，中层平滑肌细胞增生；NR1中、高剂量组和辛伐他汀组大鼠脑中动脉病理变化明显减轻，且随着剂量的增加，病变呈减轻趋势。

图1 各组大鼠主动脉的病理变化(HE，×200)

3.2NR1对CEA大鼠血压的影响 见表1。由表1可知，模型组大鼠SBP、DBP和MAP水平明显高于对照组(P<0.05)；NR1中、高剂量组和辛伐他汀组大鼠SBP、DBP和MAP水平明显低于模型组(P<0.05)，且随着NR1剂量的增加，各指标水平变化愈加明显(P<0.05)。

表1 NR1对CEA大鼠血压的影响

3.3NR1对CEA大鼠血脂的影响 见表2。由表2可知，与对照组比较，模型组大鼠TG、TC和LDL-C水平均明显升高(P<0.05)，HDL-C水平明显下降(P<0.05)；与模型组比较，NR1中、高剂量组和辛伐他汀组大鼠TG、TC和LDL-C水平明显降低(P<0.05)，HDL-C水平明显升高(P<0.05)，且随着NR1剂量的增加，各指标水平变化愈加明显(P<0.05)。

表2 NR1对CEA大鼠血脂的影响

3.4NR1对CEA大鼠脑组织NO和ET-1水平的影响 见表3。由表3可知，模型组大鼠脑组织NO和ET-1水平明显高于对照组(P<0.05)；NR1中、高剂量组和辛伐他汀组大鼠脑组织ET-1水平明显低于模型组(P<0.05)，且随着NR1剂量的增加，各指标水平变化愈加明显(P<0.05)。

表3 NR1对CEA大鼠NO和ET-1水平的影响

3.5NR1对CEA大鼠p38MAPK信号通路的影响 见图2和表4。

图2 NR1对CEA大鼠p38MAPK信号通路的影响

由图2和表4可知，模型组和NR1中、高剂量组组大鼠脑组织P-p38MAPK/p38MAPK和iNOS的蛋白表达明显高于对照组(P<0.05)，eNOS的蛋白表达明显低于对照组(P<0.05)；NR1中、高剂量组和辛伐他汀组P-p38MAPK/p38MAPK和iNOS的蛋白表达明显低于模型组(P<0.05)，eNOS的蛋白表达明显高于模型组(P<0.05)，且随着NR1剂量的增加，各指标变化愈加明显(P<0.05)。

表4 NR1对CEA大鼠p38MAPK信号通路的影响

4 讨论

CEA以脑AS为主，随着病情的发展，可引起缺血性脑血管病，影响患者预后。CEA的发病机制复杂，与进行性脂质沉积、高血压和VEC损伤等有关[7]。研究显示[8]，高血压及高血脂是CEA形成的主要危险因素，长期的高血压和高血脂状态可影响VEC功能，诱导动脉内膜增厚，引起脑血管管腔狭窄阻塞，影响脑局部组织血流量减少，引起脑组织缺血缺氧坏死，临床常采用高血压联合高血脂法制备大鼠CEA模型。辛伐他汀是目前常用的降脂药，可有效延缓CEA的形成[9]。NR1是从中药三七中提取的有效活性成分，具有降血压、调脂和抗氧化等多种作用，可延缓AS形成，但其具体作用机制尚不明确[10]。因此，本研究探讨了NR1对CEA大鼠脑动脉组织损伤的作用及机制，以期指导临床治疗。

本研究中，CEA大鼠脑中动脉存在明显损伤，动脉壁明显增厚，经NR1干预后，可明显减轻CEA大鼠脑中动脉组织的病理变化，降低脑中动脉壁厚度，抑制血管平滑肌增殖，还可降低血压，降低TG、TC和LDL-C水平，升高HDL-C水平，且随着浓度升高，各指标差异变化更显著，提示NR1可能呈浓度依赖性地改善AS大鼠的血压和血脂水平，抑制血管平滑肌增殖。Yao L等[11]研究显示，长期高血压可使动脉管壁增厚，形成硬化斑块。高血脂是影响CEA发生和进展的主要危险因素，血脂中的主要成分是TG和TC，LDL-C是运输内源性TC到肝外组织的主要载体，HDL-C可将肝外组织中的TC转运至肝脏组织中，进行代谢，从而降低机体的血脂水平[12]。Fernández-Friera L等[13]研究显示，血脂水平与VEC损伤密切相关，LDL-C进入血管内皮细胞后可诱导细胞氧化，促进活性氧(ROS)的产生，形成氧化修饰低密度脂蛋白(ox-LDL-C)，加重VEC氧化损伤，促进CEA的形成，提示NR1可能通过机体的血压和血脂水平，减轻血管VEC的氧化应激损伤。

本研究中，NR1干预可降低CEA大鼠脑组织ET-1和NO水平，且随着浓度升高，各指标差异变化更显著。ET-1和NO是一组由VEC分泌的细胞因子，可共同作用调节血管的收缩功能，其中NO可通过多种途径抑制ET-1的分泌，扩张血管，抑制血管平滑肌细胞的增殖，还可清除机体过多的氧自由基，减轻细胞氧化应激损伤[14]。ET-1是一种强力的血管收缩因子，可通过抑制eNOS的表达而抑制NO的合成，促进血管平滑肌增殖，诱导动脉血管壁增厚，促进CEA的形成[15]。NO主要由一氧化氮合成酶(NOS)合成，包括神经元型NOS、iNOS和eNOS。研究显示，eNOS可合成并分泌少量的NO，从而抑制收缩因子ET-1的分泌，抑制血管平滑肌增殖，活化的iNOS可合成并分泌大量的NO和过氧化物，激活组织细胞的氧化应激反应，诱导VEC的氧化应激损伤[16]。李春晓等[17]研究发现，NO和ET-1水平异常升高可反映脑组织的VEC功能，诱导组织损伤，提示NR1可通过调节脑组织NO和ET-1水平变化，保护VEC功能。

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路包括3条途径，细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)通路、c-Jun氨基末端激酶(JNK)通路及p38MAPK通路。近年来研究显示[18]，p38MAPK信号通路被磷酸化激活后，可调节下游iNOS和eNOS的表达，参与调节VEC功能。本研究中，NR1干预可降低CEA大鼠脑组织p38的磷酸化，促进eNOS的蛋白表达，抑制iNOS的蛋白表达。孙慧琳等[19]研究显示，胰高血糖素样肽1可抑制p38MAPK的磷酸化，促进eNOS的蛋白表达，减轻VEC的氧化损伤，延缓糖尿病大鼠AS的形成。钱风华等[20]研究显示，p38MAPK抑制剂可抑制iNOS的蛋白表达，改善脓毒症大鼠的心肌损伤，提示NR1可能通过抑制p38MAPK的磷酸化，上调eNOS的蛋白表达，下调iNOS的蛋白表达及NO和ET-1水平，改善VEC功能。

综上所述，NR1可通过抑制CEA大鼠p38MAPK的磷酸化，调节eNOS、iNOS的蛋白表达及NO、ET-1水平，降低血压和血脂水平，改善VEC功能，延缓CEA发展。但本研究尚处于探索阶段，其具体机制还需进一步验证。