王效军，黄 洁，梁慧琳，徐秀娟（广东医科大学公共卫生学院，广东东莞 523808）

登革病毒（DENV）有4 个血清型（DENV1‑4）[1]，肝细胞对各型DENV普遍易感，不同血清型间具有一定的交叉免疫反应，可发生抗体依赖的感染增强效应（ADE）[2]。NS1 是DENV 中主要的非结构蛋白，NS1抗体与细胞表面的相应抗原相互作用并引起信号转导，促进细胞激活增加病毒产量和释放，有助于DENV 的ADE 发病机制的形成[3]。长链非编码RNA（lncRNA）作为新的调控分子具有表观遗传、转录及转录后调控等功能在病毒感染中发挥重要生物学调控功能[4‑5]，DENV 感染致肝细胞损伤中lncRNA 的表达及可能的生物学作用尚不明确。本研究模拟建立体外DENV 感染L‑02 细胞的ADE 模型，探讨DENV感染致ADE 中lncRNA 差异表达及可能的生物学作用，为登革热的预防控制提供依据。

1 材料和方法

1.1 登革病毒液滴度测定

调整C6/36 细胞浓度为1×106个/mL，每孔加入100 μL悬液制备96孔板，DENV2病毒液（南方医科大学病原生物系惠赠）用RPMI‑1640维持液（2%FBS）连续10 倍稀释（10−1～10−8），用Reed‑Muench 方法[6]计算病毒液的滴度（TCID50）。

1.2 L‑02 细胞ADE 模拟感染条件的筛选及样品制备

（1）RPMI‑1640 培养基（10%FBS，1%青链霉素混合液）37 ℃（5%CO2）培养L‑02细胞，调整细胞浓度为1×106个/mL，每孔加入1 mL悬液制备6孔板。

（2）鼠源抗DENV1 NS1 抗体用RPMI‑1640 维持液（2%FBS）进行1:160 稀释，并与DENV2 病毒液（Moi=0.1、0.5、1.0）37 ℃孵育90 min，然后感染6 孔板中L‑02 细胞模拟ADE 效应；以RPMI‑1640 维持培养基（2%FBS）作为对照组，每组准备4份。

（3）染毒37 ℃（5%CO2）培养48 h 后，吸取上清，定量ELISA 试剂盒测定谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）吸光度值（OD），利用标准品建立回归方程，用回归方程计算每个感染滴度的数值。感染滴度计算AST/ALT 并依据如下标准判定[7]：AST/ALT<1.0为轻度损伤，AST/ALT≈1.0 为中度损伤，AST/ALT>1为重度损伤，AST/ALT>2为严重损伤。