马银凤,申培立,王彩喆,牛丹丹,田康明,王正祥*

1(天津科技大学 化工与材料学院,天津,300457) 2(天津科技大学 生物工程学院,天津,300457)

解淀粉芽胞杆菌α-淀粉酶(Bacillusamyloliquefaciensα-amylase,BAA)可以随机水解直链淀粉或支链淀粉分子中的α-1,4糖苷键,生成麦芽糊精和少量葡萄糖,是一种内切型液化酶,最适作用温度为55 ℃、最适作用pH为6～7,是一种典型的钙离子依赖型淀粉液化酶[1-2]。BAA在淀粉液化、织物退浆和食品加工等工业中具有重要应用价值,是工业上产量最大、应用领域最广的中温型α-淀粉酶[3-4]。

BAA作为我国开发应用较早的工业酶制剂之一,早在19世纪60年代就开始了工业化生产,但发酵水平一直停滞在300～500 U/mL,且酶制剂产品质量不稳定、货架期太短(3个月左右)。2009年前后,经过分子育种技术,在改善BAA酶制剂质量和货架期的同时,BAA发酵生产水平提高至1 500 U/mL以上,由此确立了BAA生产的世界领先地位[5]。但是,针对BAA工业应用属性的研究,一直以来未有很大的突破。现有针对BAA的分子进化研究,主要包括：LEE等[6]对BAA编码基因进行随机突变,发现233位的氨基酸残基与BAA的酶学性能有关；CORNELIUS等[7]通过易错PCR与DNA体外随机重排技术(DNA shuffling)对BAA编码基因进行改造,得到水解活力提高8倍的突变体BAA29,比酶活性由15 U/mg提高至140 U/mg；WU等[8]通过易错PCR对BAA编码基因进行随机突变,得到Ca2+依赖性降低的突变体Q264S；林碧瑜[9]发现BAA第28位氨基酸由天冬氨酸突变为谷氨酸可以提高比酶活性,与野生型BAA相比突变体的比酶活性提高了约30%。

BAA工业应用属性有待改善的主要方面:1)酶活性的钙离子依赖型,即如何降低其在实际工业应用中氯化钙或碳酸钙等钙盐的补加；2)如何适度提高其最适作用温度,有利于淀粉液化和加工工艺的实施。为此,本文在前期研究积累[9]的基础上,进一步对其特定氨基酸残基进行突变并解析酶学性质,研究结果对后续进一步提升BAA的应用具有显著价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种与质粒

含有BAA突变体2M6表达质粒的Bacillussubtilis2M6-A1为本实验室前期构建与保藏；B.subtilis1A717为本实验室保藏,用于质粒构建；载体pHY-WZX为本实验室前期构建[10],用于BAA及其突变体的表达；BacilluslicheniformisZ902(Δamy)[11]为酶高效表达宿主细胞,由本实验室前期通过分子改造B.licheniformisCBBD302[12]获得。

1.1.2 酶与试剂

中温α-淀粉酶工业产品,江苏锐阳生物科技有限公司;Pyrobest DNA聚合酶,Takara公司;限制性内切酶XbaI、SmaI、T4DNA连接酶和DNA分子量标准,上海生工生物工程股份有限公司;琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和小量DNA产物纯化试剂盒,北京庄盟生物科技有限公司,其他试剂除特殊要求外均为国产分析纯。

1.1.3 培养基

LB培养基(g/L)：酵母浸出物5,蛋白胨10,氯化钠10；固体培养基添加20 g/L琼脂。必要时在培养基中添加终质量浓度为20 μg/mL的硫酸卡那霉素。

产酶鉴定培养基：在固体LB培养基的基础上,加入1%可溶性淀粉[13]。

发酵培养基(g/L)：CaCl20.3,(NH4)2SO43,棉籽粉20,α-乳糖20,KH2PO410,K2HPO420,pH 7.2[13]。

1.2 实验方法

1.2.1 常规分子克隆操作

质粒DNA的提取、酶切、转化子筛选等均按照实验室常规方法进行[14]；枯草杆菌与地衣芽胞杆菌的遗传转化按照文献进行[15-16]；DNA纯化按照试剂盒说明书进行。

1.2.2 定点突变

以突变体2M6编码基因为模板,按照文献方法进行定点突变[5]。具体步骤为：以baa-28a(5′-CGATAAATGTTCCGCATCATTCTG-3′)和baa-28b(5′-CAGAATGATGCGGAACATTTATCG-3′)为突变引物,引入突变位点D28E,与两端引物BAA-1(5′-TACTCTAGAGTAAATGGCACGCTGATGCAGTAT-3′)和BAA-2(5′-TTTCTGAACATAAATGGAGCAGG-3′)组合,通过PCR扩增获得上下游两段DNA片段；再以此两段DNA片段为模板,以BAA-1和BAA-2为引物,将上下游两段DNA片段融合为突变体E2M6全长基因。采用Sanger核苷酸序列测定法确认突变基因序列。

1.2.3 突变体的表达、制备与纯化

将突变体全长编码DNA片段纯化后经XbaI酶切,并克隆入表达载体pHY-WZX的XbaI/SmaI位点,转化入枯草杆菌1A717构建重组质粒pHY-E2M6,正确构建的质粒转化入地衣芽胞杆菌Z902中,获得产酶重组菌地衣芽胞杆菌Z-E2M6。

将Z-E2M6接种入盛有50 mL发酵培养基的250 mL摇瓶,37 ℃、220 r/min条件下培养120 h；发酵结束后离心收集上清液,即为突变体粗酶液。酶液经饱和度为30%～40%的硫酸铵沉淀,再经凝胶层析柱Superdex-G75进一步纯化。纯化蛋白经SDS-PAGE分析[17],蛋白质浓度用Bradford法测定[18]。

1.2.4 酶活测定

中温α-淀粉酶酶活力按照GB 1886.174—2016《食品安全国家标准 食品添加剂 食品工业用酶制剂》进行测定[19]。酶活性定义为：1 mL液体酶在60 ℃、pH 6.0条件下,1 h液化1 g可溶性淀粉即为1个酶活力单位,以U/mL表示。

1.2.5 酶学性质分析

1.2.5.1 最适作用温度及热稳定性

将酶样在不同温度(30～90 ℃)下测定酶活力,最高酶活力值以100%计,计算其不同温度下的相对酶活力,确定最适作用温度。将酶样用pH 6.0缓冲液进行适当稀释,在不同温度(50、55、60、65 ℃)下保温1 h,间隔10 min取样,测定残余酶活力,未经热处理的酶活力值以100%计,计算处理后酶样的相对酶活力。

1.2.5.2 最适作用pH及pH稳定性

将酶样用不同pH(4～8)缓冲液进行稀释,并用对应pH缓冲液测定酶活力,最高酶活力值以100%计,计算其不同pH条件下的相对酶活力,确定最适作用pH。将酶样与不同pH值缓冲液以1∶10(体积比)混合,37 ℃静置1 h,测定酶样的残余酶活力值。未经处理的酶活力值以100%计,计算处理后酶样的相对酶活力。

1.2.5.3 金属离子及化学试剂对酶活的力影响

在反应体系中加入不同金属离子和化学试剂,终浓度为1 mmol/L或5 mmol/L,在酶的最适反应条件下测定样品酶活力,未经处理的酶活力值以100%计。

1.2.5.4 酶动力学参数的测定

将酶样用最适作用pH缓冲液适当稀释后,以不同质量浓度(0.4、1、2、4,10和20 mg/mL)可溶性淀粉溶液为底物,在最适反应条件下按照实验室常规方法[9]进行测定,并以双倒数法(Lineweaver-Burk法)作图,计算酶的动力学参数。

2 实验结果

2.1 突变体的构建与制备

以突变体2M6编码基因为模板,特异性引物序列介导BAA编码基因的定点突变,获得突变体E2M6全长编码基因。将此基因酶切后克隆入表达载体pHY-WZX中,获得了重组表达载体pHY-E2M6。进一步将此表达质粒转化入地衣芽胞杆菌Z902中,获得产酶重组菌地衣芽胞杆菌Z-E2M6。

经摇瓶发酵制备酶液,并经硫酸铵沉淀和凝胶过滤色谱进行纯化,获得了纯化的BAA突变体E2M6,经SDS-PAGE电泳鉴定,呈现单一纯蛋白条带(图1),分子质量为58 kDa,与理论大小相符。

M-蛋白分子量标准；1-B.licheniformis Z902发酵酶液；2-E2M6粗酶液；3-纯化后的E2M6图1 纯化突变体E2M6的SDS-PAGE图谱Fig.1 The SDS-PAGE profile of mutant E2M6

2.2 突变体的酶学性质

2.2.1 最适作用温度与最适作用pH

由图2-a可知，突变体E2M6的最适作用温度为60 ℃,60～70 ℃之间维持较高活性,突变体的最适酶活较野生型BAA提高了至少5 ℃；在30～60 ℃温度范围内,突变体E2M6与BAA的变化趋势大致相同；当温度升至80 ℃时,野生型BAA的酶活力明显下降(小于40%),突变体E2M6仍保留70%以上的酶活力；当反应温度升至90 ℃时,突变体E2M6仍保留20%以上的酶活力,而BAA仅残余约10%的酶活力。可见,对BAA的突变拓宽了BAA的作用温度范围。

a-温度；b-pH图2 突变体E2M6的最适作用温度与最适作用pHFig.2 Optimum temperature and pH optimal of mutant E2M6

在60 ℃条件下,测定不同pH(4.0～8.0)条件下的酶活力,结果如图2-b所示。突变体E2M6与BAA的最适作用pH相同,都为pH 6.0,且两者在不同pH条件下的酶活力大致相同,在pH 5.0～7.0范围内皆具有较高活性。

2.2.2 热稳定性与pH稳定性

BAA突变体的热稳定性和pH稳定性如图3所示。突变体在50 ℃下保温1 h后,E2M6与BAA分别保留80%、60%以上的酶活力；55 ℃保温1 h后E2M6与BAA分别保留60%、40%以上酶活力；60 ℃保温1 h后E2M6与BAA分别保留50%、30%以上的酶活力；65 ℃保温1 h后E2M6与BAA分别保留40%、15%以上的酶活力(图3-a)。综上,E2M6热稳定性较BAA有所提升。

突变体E2M6与BAA的pH稳定性趋势大致相同。当pH在6.0～9.0范围内,pH的升高对BAA及E2M6酶活力影响较小,相对酶活力保持在80%以上(图3-b)。

a-热稳定性；b-pH稳定性图3 突变体E2M6的热稳定性与pH稳定性Fig.3 The thermostability and pH stability of the mutant E2M6

2.2.3 金属离子和化学试剂对酶活性的影响

不同金属离子及化学试剂对突变体酶活性的影响结果如表1。与BAA相比,突变体E2M6酶活力对Ca2+、Mg2+、Na+等金属离子的依赖性降低；SDS对BAA及突变体E2M6酶活均有抑制作用,但与BAA相比E2M6对SDS更敏感。

表1 不同金属离子和化学试剂对突变体E2M6的影响Table 1 Effect of different metal ions and chemicals on E2M6

2.2.4 突变体E2M6动力学特征

测定突变体E2M6的比酶活力数据与动力学常数,结果汇总于表2。突变体E2M6比酶活力为185 U/mg,较BAA提高了约66%；突变体E2M6的底物亲和力较BAA显著提高,最大反应速度虽有所降低,但突变体E2M6的淀粉水解效率(κcat/Km)有所提升,较BAA提高了1.75倍。

表2 突变体E2M6的酶促学动力学特征Table 2 The kinetic parameters of the mutant E2M6

3 结论

通过研究,本文获得了BAA工业应用性能显著提升的突变体,其活力的钙离子依赖性显著降低,最适作用温度有所提高,更适合淀粉加工工业应用需求。