李瑞明 贺昱霖 程 彬 魏志强 孟忠吉

十堰市太和医院(湖北医药学院附属医院)生物医学研究所 (湖北 十堰，442000)

乙型肝炎病毒(HBV)感染呈全球分布，是导致慢性肝炎、肝硬化和肝细胞肝癌的重要原因之一[1，2]。HBV宿主范围有限，组织嗜性狭窄，用于体外感染研究的原代人肝细胞来源困难，阻碍了对HBV完整生命周期特别是病毒感染早期过程的研究，因此有必要建立一种稳定支持HBV感染的细胞模型。本研究在肝细胞系L-02中稳定表达HBV感染功能性受体钠离子牛磺胆酸转运多肽(NTCP)，从而建立高表达hNTCP的L-02细胞系，并筛选HBV易感的克隆，为研究HBV入侵细胞的机制和抗病毒药物筛选提供新的模型。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 质粒、细菌和细胞细制备 质粒hNTCP又名SLC10A1(Genebank编号：NM_003049，产品编号：CH890269)购自维真生物，骨架质粒为维真生物pENTER载体，含嘌呤霉素抗性基因。hNTCP基因通过限制性内切酶AsiSI/MluI克隆至pENTER载体，同时在hNTCP基因C末端包含一个Flag标签(图1)。大肠杆菌DH5a感受态购自北京天根。人肝细胞系L-02为本室保存。复苏后培养于含10% 灭活胎牛血清DMEM培养基。

图1 hNTCP质粒结构示意图

1.1.2 主要仪器和试剂 酶标仪(德国Eppendorf)，定量PCR仪(美国ABI stepone plus)；荧光显微镜(日本Olympus IX71)；Chamber Slides(美国Thermo Fisher Scientific)；胎牛血清、DMEM培养基、脂质体Lipofectamine3000、Trizol购自生命技术公司；FastQuant RT Kit(With gDNase)购自北京天根；质粒提取试剂盒、定量PCR试剂盒购自罗氏公司；HBsAg和HBeAg EILISA检测试剂盒购自科美公司；Flag抗体DYKDDDDK Tag(D6W5B)Rabbit mAb 购自CST公司；HBcAg兔多克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司；嘌呤霉素购自青岛生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 hNTCP编码区长1 050 bp，使用NCBI Primer Blast在线设计hNTCP定量PCR引物，跨越第一个内含子，产物全长107 bp：NTCP-U TTGAGGCACTGGCCATCTTG，NTCP-D GTGGTCATCACAATGCTGAGGTT。……