丹尼尔·多里坤 卡吾力·居买 张海平 买地尼也提·尼亚孜 伊地力斯·阿吾提2,

1.新疆医科大学第一附属医院临床医学研究院，新疆乌鲁木齐 830054；2.新疆医科大学第一附属医院小儿外一科，新疆乌鲁木齐 830054；3.新疆医科大学第一附属医院胸外科，新疆乌鲁木齐 830054

食管癌是全球常见的恶性肿瘤之一[1]，而我国是全球食管癌发病率和死亡率最高的国家，病理类型以鳞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）为主[2-3]。新疆位于“亚洲食管癌高发带”上，其发病表现出明显的地区差异和民族差异[4-6]，以哈萨克族人群发病率最高（155.9/10 万）。DNA错配修复（mismatch repair，MMR）系统有关的hMSH2 基因和脆性组氨酸三联体（fragile histldine triad，FHIT）基因的表达异常在散发性大肠癌和肺癌等肿瘤发病机制中的研究较多[7-9]。近年来研究发现hMSH2 和FHIT 蛋白表达缺失是食管癌发生、发展中的常见基因事件[10-13]，但是未见哈萨克族食管鳞癌中hMSH2 和FHIT 表达相关性的研究报道。本研究对哈萨克族食管鳞癌hMSH2 和FHIT 表达进行分析，以探讨其在食管癌发生发展中的意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2013 年5 月—2017 年5 月新疆医科大学第一附属医院（以下简称“我院”）行食管癌根治术的43 例哈萨克族食管鳞癌患者，其中男33 例，女10 例；年龄45～77 岁，平均（61.80±8.87）岁；低分化13 例、中分化25 例、高分化5 例；淋巴结转移16 例，无淋巴结转移27 例。根据AJCC 癌症分期手册第8 版进行术后病理学分期[14]，Ⅰ～Ⅱ期23 例，Ⅲ期20 例。本研究经我院医学伦理委员会审批通过，并获得患者知情同意。纳入标准：①术前术后病理均为鳞癌；②切缘病理检查示阴性；③有明确的病理分期；④完整的随访记录。排除标准：①术前接受放疗、化疗、其他特殊治疗；②同时患有其他部位恶性肿瘤。

1.2 定量聚合酶链反应（RT-qPCR）

将手术切取冻存的食管鳞癌组织及相应癌旁正常组织制备成悬液，并裂解提取总RNA。按试剂盒要求的条件获得cDNA，所得逆转录产物用于PCR 扩增（图1）。PCR 反应条件：95℃1 min 预变性，95℃变性15 s，57℃退火15 s，72℃延伸45 s，共40 个循环，65℃延伸7 min。hMSH2 基因引物序列为：5’-CACTGTCTGCGGTAATCAAGT-3’（上游）；5’-CTCTGACTGCTGCAATATC CAAT-3’（下游）。FHIT 基因引物序列为：5’-ATCTCATCAAGCCCTCTGTAGT-3’（上游）；5’-GGACGCAGGTCATGGAAGC-3’（下游）。β-肌动蛋白（β-Actin）内参照引物序列为：5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’（上 游）；5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’（下游）。PCR 反应体系由以下试剂或溶液组成：SYBR mix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 2 μL 和蒸馏水7 μL。

图1 hMSH2 和FHIT 基因PCR 产物电泳结果

1.3 免疫组织化学法检测

采用免疫组织化学Envision 法检测癌与癌旁组织中hMSH2 和FHIT 蛋白的表达情况。标本经常规脱蜡、水化、抗原修复，滴加一抗（均为1∶200），于4℃冰箱过夜。次日加二抗，DAB 显色。PBS 代替一抗作阴性对照。hMSH2 以细胞核出现棕色颗粒为阳性表达，FHIT 以细胞质内出现棕色颗粒为阳性表达。参照有关文献[11]制订阳性标准：每张切片高倍镜下随机选取5 个视野，计数100 个细胞，按照阳性百分比进行结果判定。hMSH2 表达分为表达阳性和表达缺失，肿瘤细胞中＜30%的细胞核或完全没有染色的分为表达缺失。根据细胞质染色的强度，FHIT 表达分级为表达阳性和表达缺失。

1.4 统计学方法

采用SPSS 24.0 对所得数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，组间比较采用t检验；计数资料采用例数和百分率表示，组间比较采用χ2检验。采用Kaplan-Meier 单因素法和COX 多因素回归进行生存分析。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 食管鳞癌及其癌旁正常组织中hMSH2 和FHIT基因mRNA 的表达水平

RT-q PCR 检测hMSH2 和FHIT 基因mRNA 的表达水平，结果显示食管鳞癌组织中hMSH2 和FHIT两个基因的mRNA 的表达水平显著低于癌旁正常组织，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表1。

表1 食管鳞癌和癌旁正常组织中hMSH2和FHIT 的mRNA 表达水平（n=30，）

表1 食管鳞癌和癌旁正常组织中hMSH2和FHIT 的mRNA 表达水平（n=30，）

注：FHIT：脆性组氨酸三联体

2.2 食管鳞癌及其癌旁正常组织中hMSH2 和FHIT蛋白的表达情况

hMSH2 蛋白阳性产物主要定位于细胞核（部分细胞质亦有表达），FHIT 蛋白阳性产物位于细胞质（图2，见封三）。hMSH2 蛋白在食管鳞癌及其癌旁正常组织中阳性表达率分别为60.5%（26/43）和91.7%（22/24），与癌旁正常组织比较，食管鳞癌组织中hMSH2 表达缺失，差异有统计学意义（P ＜0.05）。FHIT蛋白在食管鳞癌及其癌旁正常组织中阳性表达率分别为55.8%（24/43）和91.7%（22/24），与癌旁正常组织比较鳞癌组织中FHIT 表达缺失，差异有统计学意义（P ＜0.05）。

2.3 食管鳞癌患者中hMSH2 和FHIT 的蛋白表达水平与临床病理学特征的关系

hMSH2 蛋白表达缺失与分化程度（P=0.020），淋巴结转移（P=0.028）及术后病理分期（P=0.014）有关。FHIT 蛋白表达缺失与浸润深度有关（P=0.031）。hMSH2 和FHIT 蛋白表达缺失与食管鳞癌患者的性别无关（P ＞0.05）。见表2。24 例FHIT 表达阳性的食管鳞癌标本中hMSH2 表达阳性19 例，阴性5 例，阳性率为79.1%（19/24）；在19 例FHIT 表达阴性的食管鳞癌标本中hMSH2 表达阴性7 例，阴性率为36.8%（7/19）。43 例患者中，hMSH2、FHIT 表达相一致的共19 例，占44.1%（19/43），统计学分析发现hMSH2 表达与FHIT 表达呈正相关（r=0.453，P=0.03）。

表2 hMSH2 与FHIT 的表达与哈萨克族食管鳞癌患者临床病理学特征的关系

2.4 食管鳞癌患者中hMSH2 和FHIT 的蛋白表达水平与患者预后的关系

生存分析结果提示，在食管鳞癌组织中hMSH2 基因表达阳性的患者生存率高于基因表达缺失的患者，两组比较差异有统计学意义（P=0.001）。而FHIT 基因表达阳性和表达缺失组患者生存率比较，差异无统计学意义（P=0.098）。见图3。

图3 hMSH2 和FHIT 基因生存曲线

2.5 哈萨克族食管鳞癌患者的COX 生存分析

单因素生存分析结果显示hMSH2 基因表达缺失、术后病理分期及N 分期等因素与患者预后相关（P ＜0.01）；将hMSH2 基因表达缺失、术后病理分期及N 分期纳入多因素分析结果显示，hMSH2 基因表达缺失及肿瘤分化程度高是哈萨克族食管鳞癌患者不良预后的独立危险因素。见表3。

表3 哈萨克族食管鳞癌患者的COX 生存分析

3 讨论

复制后错配修复基因hMSH2 的表达缺失，是食管鳞癌发生发展过程中的重要分子事件，hMSH2 的表达缺失导致其错配修复功能的缺陷[12,15]。FHIT 作为一种肿瘤抑制基因，自发现以来就引起了广泛关注[10,16-18]。FHIT 蛋白表达缺失或减弱可能是hMSH2 错配修复功能的丧失，导致FHIT 基因异常转录和翻译造成的[9,17,19]。Bekar 等[20]在环境致癌因素密切相关的肿瘤中发现FHIT 蛋白表达失活或减弱。哈萨克族食管鳞癌的发病与环境因素相关，同时有明显的家族聚集现象[21-23]。

本研究中食管鳞癌组织hMSH2 和FHIT 基因的mRNA 的表达水平低于癌旁正常组织，hMSH2 和FHIT蛋白在食管鳞癌旁正常组织及癌组织中阳性表达率分别为91.7%、60.5%和91.7%、55.8%，阳性表达率均呈下降趋势，可见在食管鳞癌的发生中这两种基因表达缺失起到了一定的作用[24]。既往研究中[15,25]，hMSH2表达缺失与食管鳞癌患者淋巴结转移、浸润深度和分化程度等评估恶性程度的因素相关。本研究中，有淋巴结转移、分化程度越低、病理分期越晚的病例hMSH2表达缺失率显著升高。而FHIT 蛋白表达缺失与浸润深度有关。本研究提示hMSH2、FHIT 表达缺失与哈萨克族食管鳞癌侵袭、转移有关。进一步通过hMSH2 和FHIT 的相关性分析发现二者的表达呈正相关，提示两种基因表现为一致表达，与赵阿红等[19]和Sarli 等[26]的观点一致，进一步显示了hMSH2 基因表达异常引起了FHIT 基因异常表达，从而影响FHIT 基因的抑癌基因的功能。同时hMSH2、FHIT 相关蛋白的表达缺失促进了食管鳞癌的侵袭性和淋巴结转移，从而影响肿瘤进展。此外，发现hMSH2 表达缺失的患者生存期明显低于阳性表达的患者，差异有统计学意义（P ＜0.05），提示hMSH2 可能是预测食管鳞癌患者预后的一个潜在指标，FHIT 的表达也有相似的趋势。hMSH2、FHIT表达缺失的患者的临床转归最差，这与Chen 等[10]以及Su 等[15]的结果一致。

综上所述，哈萨克族食管鳞癌发生发展过程中hMSH2、FHIT 基因表达的持续减少或丢失可能是其发病的重要机制，故联合表达的检测可作为预测预后重要指标。今后将增加病例对hMSH2、FHIT 基因的深入研究，将为食管鳞癌的诊断和治疗提供新的视角。