黄佳丽 陈臻瑶 雷天瑶 王朝霞 程志祥

南京医科大学第二附属医院肿瘤医学中心，江苏南京 210011

肺癌是发病率和死亡率增长最快，对全世界人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一[1]，约70%的肺癌为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）[2]。NSCLC 最常见的驱动基因是表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）[3]，以这一驱动基因为靶点的表皮生长因子受体酪氨酸酶抑制剂（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI），在临床上取得了肯定的疗效。然而，无论第1 代或第2 代EGFR-TKI，8～12 个月后，多数患者最终都获得了耐药性[4]，最主要的耐药机制就是T790M突变[5]。为此，研究人员开发了针对T790M 突变的第3 代EGFR-TKI——奥希替尼，然而奥希替尼的获得性耐药仍不可避免的出现。EGFR-TKI 的获得性耐药是目前治疗EGFR 突变NSCLC 面对的巨大难题，因此，克服EGFR-TKI 的获得性耐药尤为重要。本研究使用NSCLC 细胞株HCC827，通过浓度递增法构建奥希替尼耐药细胞株HCC827OR，并探讨其耐药机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞株 HCC827 购自中科院细胞库，HCC827OR细胞株由程志祥和王朝霞课题组构建。

1.1.2 药品与试剂 奥希替尼（HY-15772）购于MCE 公司；RPMI-1640（61870036）、FBS（16140071）、胰酶（25 200072）购于Gibco 公司；CCK8（K1018）购于APExBIO公司；兔 抗人EGFR（4267S）、p-EGFR（2220S）、AKT（9272S）、p-AKT（9611S）、ERK（4695S）、p-ERK（4370S）、E-cadherin（3195S）和Vimentin（5741S）购于CST 公司；鼠抗人GAPDH（HRP-60004）购于Proteintech 公司；上述抗体的稀释比例为1∶1000。

1.2 实验方法

1.2.1 耐药细胞株的建立 初始，给予10 nmol/L 奥希替尼处理细胞。初筛时，按10 nmol/L 的浓度差提升，直至细胞稳定；浓度提升至亲本细胞半抑制浓度（IC50）的10 倍时按100 nmol/L 的浓度差提升；直至细胞能在2 μmol/L 的含药培养基中稳定生长。

1.2.2 细胞对药物敏感性的检测 细胞经奥希替尼孵育72 h，CCK8 孵育2 h，酶标仪（BioTek，ELx800）检测吸光度（OD）值。计算IC50及RI。抑制率=[（对照组OD 值-实验组OD 值）/（对照组OD 值-空白组OD 值）]×100%，RI=IC50（耐药细胞）/IC50（亲本细胞）。……