李瑶，巨晓洁，2，汪伟，2，刘壮，2，谢锐，2，褚良银，2

（1四川大学化学工程学院，四川成都610065；2四川大学高分子材料工程国家重点实验室，四川成都610065）

生长激素（growth hormone，GH）是由人脑垂体分泌的一种单链多肽分子，通过促进软骨细胞增殖和蛋白质合成以及调节体内糖、脂肪和微量元素等物质代谢，保证人体的正常生长发育[1]。儿童生长激素分泌不足会导致身材矮小。生长激素缺乏症（growth hormone deficiency，GHD）是儿科临床常见的内分泌疾病之一[2]。20世纪80年代末期，研究者们利用基因重组技术，获得了氨基酸序列及组成与天然人生长激素完全相同的重组人生长激素（recombinanthuman growth hormone，rhGH），逐渐成为治疗各种生长激素缺乏症及并发症的首选药物。rhGH发展至今三十余年，其用途已不再局限于治疗儿童生长激素缺乏症，在临床上也被应用于特纳综合征（Turner syndrome）[3-4]、充血性心力衰竭[5-6]、慢性肾功能不全[7-8]和严重烧伤[9-10]等疾病。

作为一种多肽分子，rhGH存在稳定性差、易失活或分解、体内半衰期短等问题。目前临床使用的rhGH冻干粉针制剂或水针制剂均需长期频繁皮下或肌肉注射给药，注射部位常出现疼痛红肿、皮下硬结和脂肪萎缩等副作用[11]，导致患者尤其是儿童患者依从性极差。在制剂生产和运输过程中，rhGH分子也容易受不当干燥方式[12]和路途颠簸[13]等因素的影响而失去药物活性。因此，开发新型rhGH给药系统有着极其重要的研究意义和临床价值。国内外研究者们在该领域进行了大量研究工作，主要包括两个方向：①通过对rhGH进行化学修饰、构建融合蛋白、构建rhGH缓释微球给药系统等方法，延长rhGH体内半衰期，实现长效治疗，降低注射频率；②开发rhGH新型给药方式以避免注射，主要包括经皮给药、肺部给药和鼻腔黏膜给药。已有相关文献对rhGH制剂的研发状况进行了综述，但发表时间较早[14-15]，仅是将可实现rhGH长效化的各类方法罗列出来[16]，并未对rhGH分子进行修饰和改变其给药途径两大类进行区分。本文从rhGH长效化制剂和非注射给药途径两个方面，综述了其类型、有效性以及潜在的问题，以期使读者能够更全面、更清楚地了解该领域的研究状况；并对该领域的未来研究提出了发展方向，以期为进一步开发安全有效的rhGH新型给药系统提供参考。

1 rhGH长效制剂

rhGH长效制剂可以通过增加蛋白类药物的体内循环时间改善其药代动力学和药效学性质、延长其半衰期等方式，在1周至超过1个月的时间内直接降低注射频率[17]。目前研究较多的rhGH长效化方法主要包括对rhGH进行化学修饰[18]、构建融合蛋白[19]和构建缓释微球给药系统[20]。

1.1 化学修饰

对rhGH进行化学修饰，增加其分子量、表观尺寸等理化性质，可以降低rhGH的肾脏清除率，延长其体内半衰期，实现长效治疗。在已报道的化学修饰技术中，研究最多的是利用聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）及其衍生物通过共价键方式对rhGH进行结构修饰。这是由于PEG是一种具有生物惰性且无免疫原性的线性大分子聚合物，对rhGH进行PEG化修饰[21]，可以避免rhGH被网状内皮系统摄取，并且其经肾脏过滤后，清除率较低。PEG分子可以和rhGH分子中10个赖氨酸残基进行不同程度的偶联，其中有4个位点处于rhGH与受体的结合部位，直接影响rhGH的生物活性[22]，并且，rhGH体内半衰期随着PEG偶联数量增多相应延长，但其与受体结合的活性将急剧下降[23]。因此，研究者们从PEG的分子量、修饰位点、结构类型（如分支型或支链型）、偶联数量等方面开展研究，以期在改善rhGH长效性能的同时保留其药物活性。近年来，已有多家制药公司相继开展了PEG化rhGH的研发工作，如表1所示。

表1 PEG修饰rhGH研究

de Schepper等[24]研发了一种末端修饰PEG的rhGH（NNC126-0083）期望针对患有GHD的儿童实现每周一次给药，并系统探究了此单剂量PEG化rhGH的安全性、耐受性、药代动力学和药效学性质，30名儿童受试者在临床研究中未发现短期安全性或局部耐受性问题。血清胰岛素样生长因子-Ⅰ（insulin-like growth factor-Ⅰ，IGF-Ⅰ）常用于rhGH制剂治疗的疗效评价和安全性检测[25]，在所有NNC126-0083试验组中均观察到了IGF-Ⅰ水平升高，但注射3天后，IGF-Ⅰ反应开始下降，并不是如预期的那样持续一周，因此IGF-Ⅰ结果并不令人满意。

Jintrolong™是我国长春金赛药业研发的PEG化rhGH长效制剂，为rhGH与分支型PEG组成的共价偶联物。在I期临床试验中，患有GHD的儿童单次给药后，IGF-Ⅰ水平升高并能持续一周，与每日持续注射rhGH没有显著差异[26]。在对健康成人进行单剂量给药的耐受性试验和药代动力学试验中[27]，在测试的所有剂量水平下，受试者均表现出良好的耐受性，并具有更长的半衰期和较低的血浆清除率，且无明显的rhGH蓄积。Jintrolong™的多剂量药物代谢动力学试验的安全性和有效性，也在Ⅱ期和Ⅲ期临床试验中得到了肯定[28]。Jintrolong™于2014年被原国家食品药品监督管理总局（SFDA）批准上市，成为全球首支上市的PEG化学修饰的长效rhGH注射液。

PEG化修饰rhGH技术已经较为成熟，但仍然存在一些问题。例如，对rhGH进行PEG修饰时，可被修饰的位点较多，从而增大了纯化难度，增加了生产成本[32]；PEG化修饰在延长rhGH体内作用时间的同时会阻碍其与受体的结合，使rhGH活性降低[23]；临床前灵长动物研究发现，PEG在脉络丛上皮细胞中有积聚现象[16]。并且，近期研究表明，rhGH长效制剂在治疗期间IGF-Ⅰ升高可能与胰岛素敏感性受损有关[33]，将来的研究工作应更多地关注大剂量rhGH长效制剂治疗安全性的随机对照试验，尤其是检测血清IGF-Ⅰ水平升高引起的不良反应。

1.2 融合蛋白

尽管PEG修饰的rhGH不受肾小球滤过的影响，但仍能和肾内GH受体结合，经过胞吞作用被蛋白酶完全或部分代谢[19]，从而影响治疗效果。通过基因工程等技术，选用半衰期较长、分子量较大的蛋白分子为载体与rhGH构建具有双重功能的融合蛋白，可以减少rhGH与受体的结合数量，降低受体介导的清除效应。国内外多家制药公司对rhGH融合蛋白开展了研发，包括将rhGH与白蛋白、免疫球蛋白片段、GH受体的细胞外GH结合蛋白片段、人绒毛膜促性腺激素（HCG）C端肽等融合，如表2所示。

表2 rhGH融合蛋白研究

Kim等[43]将rhGH与免疫球蛋白G的Fc片段（IgG Fc）进行融合，制备了一种rhGH-Fc融合蛋白，较大的表观尺寸抑制了Fc融合蛋白从血液向血管外组织转运，降低了肾脏清除率。胞吞后，该融合蛋白在内涵体的酸性pH条件下可与新生儿Fc受体（FcRn）结合，并在血液的碱性pH下释放，实现Fc融合蛋白的再循环，进一步延长rhGH的半衰期[44]。对雄性SD大鼠和垂体切除SD大鼠进行皮下注射rhGH-Fc，评价其药代动力学和药效学，结果表明，单次皮下注射rhGH-Fc在一周内持续缓慢释放，半衰期延长至51.1h，并能引起大鼠体重的快速增加和胫骨宽度的增长，间隔一周两次注射rhGH-Fc的效果与每天注射相同剂量的rhGH效果相当。GX-H9是将rhGH融合到由人免疫球蛋白D（IgD）和人免疫球蛋白G4（IgG4）组成的复合Fc片段中制备得到的新型rhGH长效化制剂，临床试验中，45例接受或未接受rhGH治疗的GHD患者在3个月的GX-H9给药期结束时，均观察到GX-H9的rhGH总释放量与剂量的增加成比例，平均IGF-I反应维持在基线之上，同时显示出可接受的耐受性，并且没有显著的免疫原性[35]。

Somapacitan是一种新型的长效rhGH，通过将小分子结合白蛋白（1200）以非共价方式附着在rhGH上，通过促进其与内源性白蛋白的可逆结合，延迟rhGH的消除效应，从而延长作用时间。短期试验表明，每周一次Somapacitan皮下注射给药，在健康的成年人[45]以及患有GHD的成年人和儿童[46]中，均显示出良好的耐受性，在GHD儿童中表现出与每日皮下注射rhGH相似的疗效。在7个国家的16个内分泌中心进行的Ⅲ期临床试验结果表明，Somapacitan可使腹部脂肪减少、骨骼肌增加，不良事件仅与注射部位反应有关，其总体治疗效果与每日注射rhGH替代治疗的效果一致[46]。

rhGH通过细胞表面的Ⅰ型细胞因子受体（growth hormone receptor，GHR）发挥作用，在生理条件下，rhGH与其受体的胞外域结合蛋白片段（growth hormone binding protein，GHBP）的交联复合物没有生物学活性但能延缓清除。Wilkinson等[41]将rhGH与GHBP融合得到了一种有效且作用持久的rhGH长效制剂ProFuse GH。其分子模型及受体激活示意图如图1所示，该融合蛋白形成了一个首尾相接的二聚体结构，它为rhGH及其结合蛋白提供了一个天然的储备库，并在以单体形式融合能够结合并激活GHR。在大鼠中，与天然rhGH相比，ProFuse GH的清除率大约是其1/300，单次注射可在10天内持续发挥促生长作用。

图1 分子模型及采体激活示意图[41]

融合蛋白在保留治疗性蛋白生物活性的同时也具有一些抗体的性质，rhGH融合的蛋白片段是否会导致一些尚未发现的细胞毒性等副作用仍需要在研究的过程中进行长期监测。除此之外，融合蛋白表达量低、分离纯化复杂、价格高昂等问题也限制着其进一步发展。

1.3 缓释微球

随着生物可降解材料的快速发展，新型药物微球缓控释系统逐渐兴起。将蛋白类药物吸附或分散在可生物降解的高分子材料中，制备成粒径为1～300μm的球状微粒，在体液的溶蚀作用和药物浓差推动作用下，可以实现蛋白类药物的缓慢释放[48]。目前已研究报道的rhGH缓释微球主要以乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）[49]、聚乳酸（PLA）[50]、透明质酸（HA）[51]等高分子作为微球骨架材料。

美国Genentech公司曾上市了第一个将rhGH包载在PLGA微球中的rhGH长效缓释制剂Nutropin DepotTM[52]，可实现一个月的持续释放。但后续研究发现其注射部位会产生硬结、红斑，并且PLGA在体内降解为乳酸和羟基乙酸，但酸性降解产物会使局部微环境pH降低，易造成rhGH失活和释放不完全，同时由于生产成本高等问题，Nutropin DepotTM于2004年退市[53]。Wang等[54]采用水/油/水乳液-溶剂蒸发法将聚缩酮PCADK与PLGA共混，制成了具有较大孔洞的PCADK/PLGA微球，这些大孔洞有利于酸性物质的排出和缓冲液的进入，可以改善微球内部由于PLGA降解所产生的酸性环境，载有rhGH的PCADK/PLGA微球在去垂体大鼠体内能释放两周时间，并显示出比纯PLGA微球更强的IGF-Ⅰ浓度响应，rhGH生物利用度得到明显提高。然而，大的孔洞必然导致溶剂蒸发过程中rhGH容易从微球中逸出，因此PCADK/PLGA微球中rhGH包封率并不够理想。除此之外，PLGA微球负载rhGH后粒径通常较大（50～60μm），无法在注射介质中有效悬浮，也无法通过细针注射。

HA是一种具有高度生物相容性和可生物降解性、安全无毒、无抗原性的天然高分子，且没有类似PLGA降解造成的给药缺陷，是蛋白多肽类药物理想的载体材料[55]。Kim等[51]采用喷雾干燥技术制备了一种载有rhGH的HA缓释微颗粒（SRrhGH），也被称为LB03002，载药量可达20%，其平均粒径约为5μm，因此悬浮液的注射体积较小，可以很容易地使用26号针头注射。动物实验表明，SR-rhGH一次给药后，可诱导食蟹猴IGF-Ⅰ水平持续升高6天。为期3年的临床研究表明，青春期前未经治疗的GHD儿童皮下注射SR-rhGH［0.5～0.7mg/(kg·周)］，与每日皮下注射rhGH相比，具有相似的疗效和更高的安全性[56]。随后韩国进行了Ⅱ期临床研究，确定SR-rhGH可以用于治疗青春期前儿童特发性矮小症时，注射剂量为0.7mg/(kg·周)，每日体内释放rhGH不低于0.05mg/kg[57]。2007年，韩国食品药品管理局（KFDA）批准了这种以HA缓释微球为载体的rhGH长效制剂Declage™上市。

缓释微球系统是实现rhGH长效化的有效途径之一，但是由于微球的粒径小、比表面积高，缓释微球制剂普遍存在释药初期药物突释等问题[58-59]，研究者们还应进行更深入的研究，以获得更好的缓控释效果。

2 非注射给药途径

虽然上述rhGH长效化技术获得了较好的长效治疗效果，但这些rhGH长效制剂仍然局限于注射给药，长期注射所带来的各种问题仍然无法解决。为了提高患者的依从性，一些非侵入型的rhGH自主给药途径受到了研究者们的关注。目前，研究最多并行之有效的新型给药途径主要包括经皮给药[60]、肺部给药[61]和鼻腔黏膜给药[62]。

2.1 经皮给药

经皮给药具有方便安全、可控释药、血药浓度稳定等特点，在药物递送领域具有显著优势和应用潜力。蛋白类药物由于具有相对较大的分子尺寸，很难直接跨过皮肤角质层屏障而被吸收[63]，为了解决这一问题，研究者们开发了包括使用微针技术[64]、离子导入[65]、吸收促透剂[66]和超声导入[67]等各种经皮给药促透技术，促进蛋白类药物的经皮吸收。

Yang等[68]将醛改性HA与rhGH的N端氨基通过偶联反应合成了一种共轭化合物HA-hGH，开发了一种利用受体介导的hGH经皮给药系统，HA-hGH的化学结构式和其经皮给药过程如图2(a)所示。与HA结合后，hGH的二级结构保持不变。荧光显微镜下，可以清楚地观察到用异硫氰酸荧光素（FITC）标记的HA-hGH在小鼠背部经皮给药后，HA-hGH有效地渗透到了皮肤真皮层，经皮渗透能力显著增强。

微针阵列是一种高效的经皮促透技术，可以无痛地穿透皮肤角质层，形成对皮肤无损伤的微米级孔道，药物通过孔道直接递送至真皮层进入体循环，显著提高了药物的经皮吸收效率，改善了患者的用药依从性，特别适用于生物大分子药物的体内高效递送。目前，研究者利用微针阵列介导rhGH经皮给药已进行了初步尝试，采用可生物降解或可溶解的聚合物材料制成可溶性微针阵列，该类微针阵列具有生物相容性好、不易断裂、载药量大等优点[69]。Lee等[70]利用羧甲基纤维素和海藻糖制成了一种可溶性微针阵列，用于介导rhGH经皮给药，SD大鼠经皮给药的数据表明，在约170μg的给药剂量下，rhGH的绝对生物利用度为71%，但是，该微针阵列整体负载rhGH，微针未刺入皮肤的部分溶解不完全，造成给药剂量不准确。Fukushima等[71]分别使用硫酸软骨素、葡聚糖、透明质酸、白蛋白等水溶性生物高分子制成针尖负载rhGH的可溶性微针阵列，如图2(b)所示，微针中的rhGH在4℃下可以稳定1个月，但是，该载药针尖整体在体内快速溶解，递送入体内后在不超过4h内即从血浆中被消除。Gyubin等[72]将微针阵列技术和离子导入技术联合应用，设计制造了一种新型rhGH经皮给药装置Tappy Tok Tok®，如图2(c)所示。实验结果表明，离子导入对rhGH通过微针形成的微通道透皮渗透有较大的促进作用，但该装置设计复杂、操作不便，不利于自主给药。

图2 经皮给药系统开发及装置示意图

尽管利用微针阵列实现rhGH经皮缓慢释放的研究尚未见报道，部分患者在给药部位还会出现轻微红斑，微针阵列经皮给药仍是最有望替代rhGH常规注射的新型给药方式，其疗效需要在临床试验中进一步验证。

2.2 肺部给药

早期研究表明，将rhGH直接注入到成年大鼠下呼吸道中，通过肺后生物利用度可达36%[73]，这显示出了肺作为rhGH给药途径的潜力。然而在此种给药方式下，随着剂量增加rhGH会在血液中逐渐达到饱和，生物利用度降低。随后，rhGH被制成溶液气雾剂[74]、干粉[75]等剂型用于肺部给药。

Jalalipour等[76]在利用喷雾干燥技术制备可吸入型rhGH粉末的过程中，使用不同摩尔比的二甲基-β-环糊精（DM-β-CD）探究其对rhGH聚集的保护作用，并评估了该可吸入型rhGH粉末在SD大鼠体内全身性递送rhGH的功效。随着DM-β-CD浓度增加，rhGH聚集率从9.67%降低至0.84%，说明DM-β-CD可有效防止rhGH团聚，达到更好的肺部给药效果。SD大鼠体内研究显示，当rhGH与DM-β-CD摩尔比为10、100和1000时，其肺部给药绝对生物利用度分别为25.38%、76.52%和63.97%。在之后的临床试验中，儿童吸入该rhGH粉末也表现出良好的耐受性，血清rhGH和IGF-Ⅰ水平均呈剂量依赖性增加[77]。

目前来看，rhGH肺部给药途径是一种安全可行的方式，但其仍处于临床试验或实验室研究阶段。这是由于肺部给药对rhGH的粒径和粒径分布要求较高，当颗粒粒径大于3nm时吸收较差，同时粒径分布不均匀则会造成rhGH吸入过程中的损失[78]。除此之外，长期肺部给药可能导致肺纤维化等副作用[79]。

2.3 鼻腔黏膜给药

鼻腔黏膜由于具有黏膜层薄、有效吸收面积大、蛋白水解酶浓度低等性质而成为蛋白类药物的有效给药途径之一[80]。鼻腔黏膜给药后，rhGH可以通过黏膜中丰富的毛细血管直接进入血液循环系统，避免肝脏首过效应，但鼻腔黏膜纤毛的清除作用限制了rhGH吸收，通常需加入各种吸收促进剂来增加吸收。

Baldwin等[81]使用tauro-24,25-二氢夫西地酸钠作为吸收促进剂增强rhGH鼻腔黏膜吸收，在大鼠、兔和绵羊三种动物模型中均观察到相比对照组更高的生物利用度，但之后的人体试验表明，与皮下注射rhGH相比，其绝对生物利用度极低（1.6%～3.0%）[82]。含环糊精和双癸酰基-L-α-磷脂酰胆碱（DDPC）的rhGH鼻腔黏膜给药制剂在家兔体内的生物利用度可达20%，但其主要转运途径是致死鼻纤毛细胞后透过鼻黏膜吸收，存在对鼻腔黏膜的严重损害[83]。

在已研究的各种rhGH鼻腔黏膜吸收促进剂中，必需脂肪酸（EFAs）是一种安全性极好的天然吸收促进剂[84]。基于EFAs开发的PheroidTM是一种具有微米或亚微米脂类结构的给药系统，由独立的水相和一氧化二氮气相组成，其分散结构的形态、大小和功能都可以根据药物吸收特性进行调控以满足适应证需求。PheroidTM最主要的两种结构为微囊和微海绵，如图3所示，微囊具有脂质双层膜结构，包裹一个亲水中心，直径范围在0.5～1.5μm；微海绵包含各种小储库，直径范围在1.5～5μm，两种结构均能将亲水性化合物截留在中心而将疏水性化合物截留在膜中[85]。Steyn等[86]研究了N-三甲基壳聚糖（TMC）和PheroidTM微囊对rhGH鼻腔黏膜吸收的增强作用，结果显示，PheroidTM微囊和高分子量、低季铵化程度的TMC可使rhGH生物利用度分别高达128.5%和136.1%，都有可能成为安全有效的rhGH鼻腔黏膜吸收促进剂。而针对不同结构的PheroidTM，微囊鼻腔黏膜递送rhGH的绝对生物利用度远高于相同实验条件下的微海绵[87]。但是，吸收促进剂对鼻腔黏膜始终存在一定的毒性作用，其与rhGH的各种作用机制也仍待研究，rhGH鼻腔黏膜给药还需要进行进一步的临床试验来评估长期使用的安全性。

图3 PheroidTM的两种结构[85]

3 结语

对于rhGH新型给药系统，PEG化学修饰、构建融合蛋白和缓释微球等长效化方法可以有效增加rhGH的体内循环时间，改善其药代动力学和药效学性质，获得较好的长效治疗效果。新型的经皮给药、肺部给药和鼻腔黏膜给药等非注射型给药途径，可以规避长期注射带来的注射部位红肿、皮下硬结和脂肪萎缩等问题。但同时要注意，PEG修饰rhGH易造成蛋白质活性降低缓释微球常存在初期突释现象，且融合蛋白的安全性尚未证实，而非注射给药途径中，肺部给药和鼻腔黏膜给药对制剂性能要求较高，经皮给药的缓释性能仍需要进一步研究。总之，在研究rhGH体内递送时，需要综合考虑较高的日需剂量、患者依从性、长期治疗的安全问题以及批量化生产用于商业推广的可行性。目前虽然已经有商品化rhGH长效注射制剂在一些国家获得了上市许可，但频繁注射给药带来的各种问题仍未得到解决。将rhGH长效化与非注射给药途径合理结合应成为将来实现rhGH高效递送的重要研究方向。例如将rhGH长效化制剂负载于聚合物微针阵列进行经皮无痛递送，在延长rhGH半衰期的同时也能极大地提高患者依从性。相信随着科学进步，研究者们必然会开发出优于传统频繁注射给药的rhGH给药系统，最大限度地发挥rhGH治疗的促生长作用及其他生理益处，这也将为其他替代治疗型蛋白类药物在体内的高效递送开辟出新的途径。