秦磊磊 胡艳 黄龙 王艳 江一飞 刘恒 韩淑君

摘要 在魔芋膳食纤维固体饮料大肠菌群检测用稀释液中添加350 g/L甘油，抑制魔芋葡甘聚糖的凝胶速度，改善检测过程中样品稀释液流动性，确保试验的顺利开展，通过抑菌试验、对比试验等方法研究甘油生理盐水稀释液检测大肠菌群的适用性，结果表明，350 g/L甘油生理盐水稀释液对大肠菌群无明显抑制，甘油生理盐水稀释液检测魔芋膳食纤维固体饮料中大肠菌群有较好的适用性。

关键词 甘油;魔芋膳食纤维固体饮料;大肠菌群;检测;适用性

中图分类号 TS207.4 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2021）09-0180-02

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.09.049

Abstract 350 g/L glycerol was added to the dilution of konjac dietary fiber solid beverage， inhibiting the gel speed of konjac glucomannan， improving the fluidity of the sample diluent during the detection process， ensuring the smooth development of the experiment， and studying the applicability of the glycerol physiological saline diluent to detect coliform bacteria by means of bacteriostatic test and comparative experiment. The results showed that 350 g/L glycerin normal saline diluent had no obvious inhibition on coliform bacteria， and the glycerol saline diluent had better applicability in detecting coliform bacteria in konjac dietary fiber solid beverage.

Key words Glycerin;Konjac dietary fiber solid drinks;Coliform bacteria;Detection;Applicability

大肠菌群是粪便污染指示菌[1]，是评价食品质量卫生状况及安全的重要指标，与肠道致病菌有较为密切的关系[2]，对评价食品安全状况及食品生产、运输、储存环境评估有重要意义。目前，食品中大肠菌群检测的方法主要为GB 4789.3—2016[3]，该方法对样品的稀释均采用无菌磷酸盐缓冲液或生理盐水，针对特殊样品未提供适用性更好的稀释液，魔芋膳食纤维固体饮料具有良好的胶凝性[4]，使用磷酸盐缓冲液或生理盐水稀释时，样品稀释液形成强凝胶致试验无法正常进行，该试验使用350 g/L甘油-生理盐水稀释液[5]延缓样品稀释液形成凝胶，以改善试验效果。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

魔芋膳食纤维固体饮料;大肠埃希氏菌（Escherichia coli，E.c）CMCC44102，中国医学微生物菌种保藏管理中心;肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae，K.p）CICC10870，中国微生物菌种保藏管理中心;弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii，C.f）CICC10404，中国微生物菌种保藏管理中心;产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes，E.a）CICC10293，中国微生物菌种保藏管理中心;甘油，西陇科技;氯化钠，西陇科技;PBS缓冲液，赛默飞;平板计数培养基，海博生物;大肠菌群质控样品，中国检验检疫科学研究院测试评价中心。

1.2 试验设备

生化培养箱（LRH-250），广东韶关医疗器械有限公司;灭菌锅（BXM-50），上海博迅实业有限公司;生物安全柜（Bio-ⅡA），上海泰事达机电设备有限公司;电子天平（ME2002），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司;黏度计（DV2T），美国博勒飞公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菌悬液的制备。

从大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯氏菌、弗氏柠檬酸杆菌、产气肠杆菌标准菌株斜面挑取一环菌落分别转入100 mL营养肉汤中培养24 h，平板计数法培养24 h测定初始培养液菌浓度，同时划斜面培养备用，将初始菌液使用生理盐水稀释至约为107、105、103 CFU/mL备用。

1.3.2 抑菌效果评价。

用PBS洗取试验菌24 h新鲜斜面培养物，并稀释至5.0×105～4.5×106 CFU/mL菌悬液备用。取无菌试管，先加入5.0 mL 350 g/L甘油生理盐水，再加入0.1 mL试验用菌悬液，迅速混匀相互作用5 min。分别吸取1.0 mL试验菌与350 g/L甘油生理盐水混合液做活菌培养计数，作为试验组。同时用PBS代替甘油生理盐水，进行平行试验，作为阳性对照。取同批次PBS、培养基作阴性对照。试验重复3次，计算抑菌率[6]。

1.3.3 加标比较试验。

魔芋膳食纤维固体饮料按照GB 4789.3—2016使用350 g/L甘油生理盐水稀释液稀释，吸取1 mL混合菌悬液接种至上述魔芋膳食纤维固体饮料稀释液中，进行大肠菌群检测;使用无菌生理盐水替代样品，以生理盐水为稀释液作为参比对照，检测结果取对数，每个接种水平进行6次平行试验[7]。

1.3.4 协同试验。

协同试验采用质控样品污染无菌膳食纤维固体饮料基体的方式在不同实验室中展开，按照说明书对质控样品水化，将185 mL 425.5 g/L甘油-生理盐水稀释液与40 mL水化液合并混匀，加入基体充分混匀，此为样品原液，进行大肠菌群检测，菌落数总量=样品原液菌浓度（CFU/mL）×225（mL）。

2 结果与分析

2.1 抑菌效果评价

使用大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯氏菌、弗氏柠檬酸杆菌和产气肠杆菌作为试验菌评价350 g/L甘油生理盐水稀释液的抑菌效果，根据表1结果显示，菌落总数阳性对照与试验组差异不大，抑菌率均远小于50%，表明350 g/L甘油-生理盐水改良稀释液对4种典型受试菌无明显抑制作用。曾爱兵等[8]使用40%甘油小牛血清保存大肠埃希氏菌和克雷伯氏菌，12个月后仍有良好的生物学性状且反复冻融仍无影响，表明一定浓度的甘油对大肠菌群基本无抑制作用。

2.2 加标比较试验

对102～104 CFU/g接种水平下使用改良稀释液和生理盐水结果进行配对t检验分析[9]，结果显示（表2），102、103、104 CFU/g不同接种水平下，配对t检验P值分别为0.16、0.23和0.11，说明使用改良稀释液与生理盐水检测时不存在显著差异。

2.3 协同试验

协同试验在6家实验室中展开，考核使用350 g/L甘油-生理盐水稀释液检测大肠菌群结果与特性值的一致性。结果显示（表3），6家实验室结果均在特性值区间范围内，符合质量控制要求，稀释液中添加350 g/L甘油对质控样品检测结果影响不大。

3 结论

350 g/L甘油-生理盐水稀释液与生理盐水稀释液检测大肠菌群结果无显著性差异，不同实验室协同试验结果均在特性值区间内，抑菌效果评价也表明350 g/L甘油生理盐水对大肠菌群无明显的抑制作用，同时此甘油浓度稀释液可有效延缓检验中凝胶的形成，对检测魔芋膳食纤维固体饮料中大肠菌群有一定的适用性，因魔芋膳食纤维固体饮料样品特殊，无法严格与标准方法进行比对，对比试验结果可能存在一定误差，同时为完整的方法学研究带来了困难，针对此样品大肠菌群检验的方法学研究有待进一步探讨[10]。

参考文献

[1] 白凤翎，邢怡，马春颖.食醋大肠菌群检验国家标准方法改进研究[J].中国酿造，2006，25（12）：54-56.

[2] 王立波.茶叶中大肠菌群检测方法的研究[D].重庆：西南大学，2008.

[3] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局.食品微生物学检验 大肠菌群计数：GB 4789.3—2016[S].北京：中国标准出版社，2017.

[4] 李娜，罗学刚.魔芋葡甘聚糖理化性质及化學改性现状[J].食品工业科技，20015，26（10）：189-191.

[5] 秦磊磊，李素媛，黄龙，等.魔芋固体饮料微生物项目检测用稀释液的选择及适用性研究[J].湖北农业科学，2019，58（11）：107-111，171.

[6] 中华人民共和国国家卫生健康委员会.抗菌和抑菌效果评价方法：WS/T 650—2019[S].北京：中国标准出版社，2019.

[7] 雷质文.食品微生物实验室质量管理手册[M].2版.北京：中国标准出版社，2018：105-122.

[8] 曾爱兵，陈增强，杜季梅.小牛血清甘油低温保存菌种方法介绍[J].现代预防医学，2004，31（4）：610-611.

[9] 刘秀梅，卢行安，顾其芳，等.AOAC 991.14 PetrifilmTM大肠菌群测试片法与GB4789.3大肠菌群计数法的比较研究[J].中国食品学报，2010，10（6）：167-172.

[10] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.食品微生物检验方法确认技术规范：SN/T 3266—2012[S].北京：中国标准出版社，2013.