查锦宏 蒙怡 朱蕴兰 邵颖 陈安徽 张爱文 曹阳 岳明宇 朱文静

摘要 为研究球孢白僵菌在牛蒡苗中的定殖情况，采用浸种法、灌根法处理牛蒡种子，种植后每隔7 d取牛蒡苗采用组织研磨涂布法检测球孢白僵菌在牛蒡苗中的定殖情况，研究球孢白僵菌在牛蒡苗不同组织中的分布状况与定殖规律。结果表明，灌根和浸种法均能将球孢白僵菌成功定殖于牛蒡苗中，但浸种法优于灌根法。灌根处理7 d时，牛蒡苗中未检测出球孢白僵菌，14 d时牛蒡苗根、茎、叶中球孢白僵菌定殖量达最大值，随后随着时间的延长定殖量逐渐降低;浸种处理组在出苗第7 天时即有球孢白僵菌定殖，随后定殖量下降，在第28天时定殖量又升高;牛蒡种子浸种72 h处理后种植，球孢白僵菌定殖效果优于浸种48 h处理，第28天时72 h浸种组牛蒡苗根、茎、叶中球孢白僵菌定殖量较48 h浸种组分别高 34.18%、51.79%和29.66%。

关键词 球孢白僵菌;牛蒡;苗期;定殖

中图分类号 S482.3 文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2021）09-0141-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.09.036

Abstract In order to clarify the colonization of Beauveria bassiana in the roots and stems of burdock seedling，soaking and root-irrigation methods were used to detect the colonization of Beauveria bassiana in the burdock seedlings.The result showed that Beauveria bassiana could be successfully colonized in the burdock seedlings，soaking method was better than root-irrigation.There was no Beauveria bassiana in seedling of burdock at the 7 d.The colonization amount of Beauveria bassiana at the 14 d was up to the highest level，and then，the Beauveria bassiana amount was decreased.In the soaking treatment group，Beauveria bassiana started to colonized in burdock seedling，then the colonization amount decreased，and then increased at 28 d.After soaking seeds of burdock for 72 h，the colonization effect was better than that of for 48 h.The colonization amount of Beauveria bassiana in the root，stem and leaf of burdock seedling of 72 h soaking treatment group were 34.18%，51.79% and 29.66% higher than that of 48 h soaking treatment group.

Key words Beauveria bassiana;Burdock;Seedling stage;Colonization

牛蒡（Arctium lappa）又名大力子、东洋参、东洋牛鞭菜等，属菊科2年生大型草本植物，是药菜兼用植物，具有较高的食用及保健价值[1-3]。研究显示，牛蒡叶提取物具有抗氧化、抗菌、抗病毒、降压、增高白血球及兴奋中枢神经系统等药理作用;牛蒡子提取物具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、神经保护、利尿、免疫调节、降血糖、降血脂及对热休克反应的抑制活性[4-9];牛蒡根提取物能明显降低高脂大鼠的总胆固醇及甘油三酯水平，升高高密度脂蛋白胆固醇水平[10];牛蒡子和牛蒡根对治疗HIV也有一定的作用[11]。因此，牛蒡及牛蒡产品的消费量日益增加，牛蒡种植及加工产业已成为牛蒡主产区的重点发展产业。牛蒡种植过程中会受到病虫害的危害，常见病害有黑斑病、角斑病、白粉病、茎腐病、炭疽病、枯萎病、花叶病等，其中黑斑病、白粉病、茎腐病是牛蒡主要病害，严重影响牛蒡的产量及品质。传统的防治牛蒡病害的方法主要是化学方法。但随着人们对食品质量安全的重视，特别是国外对进口农产品农残检测标准要求的提高，使用化学农药防治病虫害受到了极大的限制，严重制约了牛蒡的生产。寻找高效的生物防治手段防治牛蒡病害将是牛蒡无公害生产及其产业持续性發展的重要保障。

球孢白僵菌（B.bassiana）是可以导致昆虫白僵病的一种真菌，是生物防治中最重要的种类[12-13]。目前已被开发用于真菌杀虫剂，并被广泛应用于防治农林害虫并产生了显著的经济、生态和社会效益，研究显示虫生真菌在植物组织定殖与植株的抗病能力直接相关[14-16]。笔者采用不同接种方式接种球孢白僵菌，考察了球孢白僵菌在牛蒡苗期的定殖情况，为球孢白僵菌在作物抗病方面的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 试验样品。牛蒡种子购于河南丰登种业有限公司。球孢白僵菌菌株保存于徐州工程学院食品（生物）工程学院发酵工程实验室。

1.1.2 仪器设备与试剂。

仪器设备：梅特勒AE200型电子天平，上海分析仪器厂;SENCO R-502B型旋转蒸发器，上海申胜生物技术公司;数显式电热恒温水浴锅HH-4，国华电器有限公司;超纯水系统，PALL Cascada LS 颇尔公司;可调高速匀浆机FSH-2A，金坛市华城润华实验仪器厂;生物显微镜BM2000，江南永新光学有限公司;真空冷冻干燥机 LGJ-10，上海比朗仪器有限公司;超低温冰箱 MDF594，日本SANYO电子有限公司;涡旋混匀器HYQ-3111，美国精骐有限公司。

试剂：葡萄糖，上海源叶生物科技有限公司;无水乙醇，徐州师范大学科技开发总公司化工厂;过氧化氢，天津市福晨化学试剂厂;氢氧化钠，天津市福晨化学试剂厂;吐温80，国药集团化学试剂有限公司。

1.1.3 培养基。SDAY培养基：蛋白胨1 %、酵母浸膏1 %、琼脂2 %、葡萄糖4 %。

1.2 试验方法

1.2.1 球孢白僵菌的培养及孢悬液的制备。

将球孢白僵菌接种于SDAY培养基并于25 ℃条件下恒温培养，待产孢后刮取球孢白僵菌孢子于0.05% 的Tween-80水溶液，充分振荡后再使用无菌水配制成浓度为1×108 CFU/mL的球孢白僵菌孢悬液，备用。

1.2.2 浸种与种植。

选取颗粒大小均一的牛蒡种子，先用无菌水冲洗后再用70% 的乙醇溶液进行表面消毒2～3 min，之后使用无菌水冲洗几遍，再用2% 的氢氧化钠溶液进行表面消毒，最后再用无菌水冲洗。晾干后，每100粒牛蒡种子浸泡在20 mL浓度为1×108 CFU/mL的孢子悬浮液中，25 ℃、120 r/min条件下浸种。浸种48 h处理的设置为48 h处理组;浸种72 h处理的设置为72 h处理组;另设对照组CK1和CK2，用0.05% 的Tween-80的水溶液浸种48和72 h的处理组分别设置为CK1和CK2处理组。种子处理后于无菌条件下自然风干。沙土高压蒸汽灭菌后装入无菌花盆，将处理好的牛蒡种子播种于花盆并在表层覆盖一层约1 cm的灭菌土，浇适量的无菌水。

1.2.3 灌根。

将表面消毒后的牛蒡种子随机分为灌根处理组和空白对照CK3组，2组播种于盛放无菌土的花盆中。待种植后的第7天，灌根组用50 mL浓度为 1×108 CFU/mL的球孢白僵菌孢子悬浮液灌根处理;CK3组用0.05% 的吐温-80水溶液灌溉牛蒡苗。

1.2.4 定殖量检测。

经浸种和灌根处理的牛蒡待出苗后的第7、14、21、28天取苗，随机剪取牛蒡苗的根、茎、叶各1 g于研钵中，加入2 mL 0.05% 吐温-80溶液并采用研磨法研磨牛蒡苗的根、茎、叶组织，匀浆液进行梯度稀释后采用涂布法涂布于SDAY平板培养基中，于25 ℃下恒温培养后记录各植物组织中球孢白僵菌的数量，并计算球孢白僵菌在1 g牛蒡苗组织中的数量。

2 结果与分析

2.1 球孢白僵菌在牛蒡根中的定殖量

采用灌根和浸种的方法接种球孢白僵菌孢悬液，检测牛蒡出苗不同时期牛蒡苗根中球孢白僵菌的数量，结果见表1。

由表1可知，3组空白对照组均未检测到球孢白僵菌。在牛蒡出苗第7天时，灌根组的牛蒡根际未检测到球孢白僵菌。浸种48和72 h组的牛蒡苗根中球孢白僵菌的菌落数显著高于出苗后期，而浸种72 h组在牛蒡苗根部的定殖量比浸种48 h组高22.92%。浸种处理组随着出苗时间的延长球孢白僵菌在根中的定殖量不断减少，但在第28天时又有所增加，但灌根组根中球孢白僵菌的定殖量随着出苗时间的延长逐渐减少。比较3个试验组牛蒡苗中球孢白僵菌的定殖量，浸种72 h更有利于球孢白僵菌在牛蒡苗根中的定殖。

2.2 球孢白僵菌在牛蒡苗茎中的定殖量

采用灌根法和浸种法处理牛蒡种子，待牛蒡出苗后测定出苗不同时期牛蒡不同组织中球孢白僵菌的定殖量，结果见表2。

由表2可知，空白对照组牛蒡苗茎中始终未有球孢白僵菌。出苗第7天时，灌根组的牛蒡苗茎中也未检测到球孢白僵菌，这与根中球孢白僵菌定殖特征相似;在出苗第14天时球孢白僵菌定殖量达到最大，但随后随着时间的延长定殖量逐渐减少。第7天时，浸种72 h组的牛蒡苗茎中球孢白僵菌的定殖量显著高于浸种48 h组，高出16.92%;浸种48和72 h组牛蒡苗茎中定殖量呈先下降后上升的趋势，在出苗第28天时，灌根组和浸种72 h组牛蒡苗茎中定殖量显著高于浸种48 h组，灌根组与浸种72 h组间虽无显著差异，但浸种72 h组定殖量高于灌根组。综合比较3个试验组牛蒡苗中球孢白僵菌的定殖量，浸种72 h组优于其他试验组。

2.3 球孢白僵菌在牛蒡苗叶中的定殖量

采用“1.2.4”的试验方法检测灌根和浸种处理牛蒡种子后牛蒡苗叶中球孢白僵菌的定殖量，具体试验结果见表3。

由表3可知，球孢白僵菌在牛蒡苗叶中的定殖规律与在根、茎中的一致，牛蒡出苗后，浸种72 h组牛蒡苗叶中球孢白僵菌的定殖量显著高于48 h组，但2个试验组中牛蒡叶中定殖量均呈先降低后升高的趋势，在第28天时72 h浸种组牛蒡叶中定殖量比48 h浸种组高29.66%。灌根组在牛蒡出苗第14天时才检测到叶中的球孢白僵菌，随后随着时间的延长定殖量逐渐下降。综合比较3个试验组牛蒡苗葉中球孢白僵菌的定殖量，浸种72 h更有利于球孢白僵菌的定殖。

3 结论

在牛蒡出芽期间采用浸种处理和灌根处理接种球孢白僵菌，研究球孢白僵菌在牛蒡苗根、茎、叶中的定殖情况。结果发现，灌根处理和浸种处理均能够成功将球孢白僵菌定殖在牛蒡苗中，浸种处理较灌根处理更有利于球孢白僵菌的定殖。灌根处理组牛蒡在出苗第7天时没有球孢白僵菌定殖，但浸种处理组已成功定殖。灌根处理组在出苗第14天时球孢白僵菌定殖量达到最大值，且高于浸种处理组，随后定殖量逐渐降低;浸种处理48和72 h组，球孢白僵菌在牛蒡苗根、茎、叶中的定殖规律相同，均呈定殖量先降低再上升的趋势。浸种72 h组在不同时期的球孢白僵菌定殖量显著高于48 h组，因此，采用浸种方式且浸种72 h更有利于球孢白僵菌在牛蒡苗期的定殖。

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