张 玲，王 利*，魏 勇，张楠驰

(1.西南民族大学 青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部和四川省重点实验室，四川 成都 610041；2.四川省畜牧科学研究院 兽医研究所，四川 成都 610041)

霍氏肠杆菌(Enterobacterhormaechei)属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，肠杆菌属(Enterobacter)[1]。霍氏肠杆菌为革兰阴性、短杆状、周生鞭毛、兼性厌氧，1989年独立成属，属于条件性致病菌[2-4]。目前，国内外对此菌的报道尚少，仅从狐狸[2]、牛[5]、林麝[6]、海龟[7]、白蚁[8]、瓜实蝇[9]等动物和人[4]中被分离鉴定出。霍氏肠杆菌对动物和人具有一定的致病性，主要危害有菌血症[1]、化脓性子宫内膜炎[2]、肺炎、化脓性疾病[10]和脑卒[11]等。CAMPOS等[12]鉴定出此菌引起早产儿血液感染。至今为止，在羊中尚未见霍氏肠杆菌的报道，本研究从患病山羊腹泻粪便样中分离鉴定到霍氏肠杆菌菌株ztl-01，并对其生物学特性进行研究，对防制霍氏肠杆菌导致的疾病有一定参考价值。

1 材料与方法

1.1 样品采自四川省某山羊养殖场的腹泻山羊粪便样品。病羊眼结膜充血、体温升高、四肢无力、呈现腹式呼吸并出现剧烈腹泻，粪便恶臭呈水样。剖检发现主要病理症状为肝脏和肾脏肿大并有很多出血点、大肠小肠充血、肠黏膜脱落、全身淋巴结普遍肿大充血。

1.2 主要试剂与仪器LB培养基购自青岛高科园海博生物技术有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒购自北京TIANGEN公司；药敏纸片、肠杆科细菌生化鉴定管均购自杭州微生物试剂有限公司；PCR仪购自Eppendorf Germany公司；凝胶成像系统、电泳仪均购自Bio-Rad公司。

1.3 细菌分离与鉴定在超净工作台内，无菌划线接种于LB固体培养基中，37℃恒温培养18 h，挑取外观一致的单菌落纯化培养、革兰染色和镜检。参照尹梦雅[13]、《伯杰氏系统细菌学手册》[14]和生化管使用说明进行生理生化鉴定，提取细菌DNA进行16S rDNA基因扩增与测序。PCR反应体系25 μL：1.1×T3 Super PCR Mix 22 μL，模板1 μL，上、下游引物各1 μL。PCR反应程序：98℃ 2 min；98℃ 10 s，55℃ 10 s，72℃ 30 s，共30个循环；72℃延伸2 min。将拼接的完整序列在NCBI上进行Blast序列比对，采用MegAlign软件进行16S rDNA基因同源性分析，采用Mega 6.0软件对同源性相近的序列构建系统进化树。

1.4 毒力基因检测参照文献[15-16]毒力基因引物，进行ompX、cpa、hly、sip、afa、fimH、papA和papC共8种毒力基因的检测。PCR反应体系与程序同1.3。ompX、cpa、hly、sip、afa、fimH、papA和papC的退火温度分别为59.0,64.0,59.6,57.0,55.0,57.0,58.0,60.0℃ 10 s，PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳和凝胶成像系统检测。

1.5 致病性试验将30只SPF小鼠(购自四川省成都市中医药研究所)随机分为试验组和对照组，每组15只。试验前小鼠禁食、禁水24 h，试验组和对照组分别注射0.2 mL的1×109CFU/mL的ztl-01菌悬液和无菌生理盐水。2组分开正常饲养，连续观察7 d。剖检病死小鼠，取肝脏、脾脏、肾脏、肠组织于4%的多聚甲醛固定，制作病理切片。

1.6 动物回归试验参照文献[17]方法对山羊进行静脉攻毒，将6只3月龄、体质量14 ～16 kg的健康山羊随机分为试验组和对照组，每组3只，试验组每只山羊通过耳静脉接种2 mL的2×109CFU/mL的ztl-01菌悬液，对照组每只通过耳静脉接种2 mL 的无菌生理盐水。2组分开正常饲养，观察、记录至7 d，分析该分离菌对山羊的致病性。

1.7 耐药基因检测参照文献[18-20]的4种氨基糖苷类药物耐药基因引物、3种磺胺类药物耐药基因引物及1种β-内酰胺类药物耐药基因引物，以提取的细菌DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系同1.3，PCR反应条件：98℃ 2 min；98℃ 10 s，耐药基因(aph(3′)-Ⅱa、aac(3)-Ⅱa、aac(6′)-Ⅰb、ant(3′′)-Ⅰa、Sul1、Sul2、Sul3、TEM 的退火温度分别为55.8，50.5，55.3，56.0，60.0，56.0，57.8，55.8℃ 10 s，72℃延伸30 s，共39个循环；最后72℃延伸2 min。取PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.8 药敏试验采用Kirby-Bauer纸片扩散法，取适量菌液均匀涂布于Mueller-HingtonAgar培养基上，将药敏纸片在培养基中，35℃培养16～18 h。本试验测量23种药物对分离菌的抑菌圈直径(IZD)，重复3次，取其平均值，根据WST125-1999纸片法抗菌药物敏感试验标准及美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)标准与指南判定结果。

1.9 生物被膜检测参照文献[15,21]采用2种方法进行细菌生物被膜能力检测，其中试管法定性检测，微孔板法定量检测，并检测不同NaCl质量浓度对霍氏肠杆菌生物被膜形成影响。在96孔板中分别加入含不同NaCl质量浓度(1.0，1.2，1.4，1.6，1.8，2.0 g/L)的TSB培养基，其余步骤同微孔板法，用不接菌的TSB培养基作为空白阴性对照。

2 结果

2.1 细菌鉴定多次纯化后的单菌落呈圆形，中央微凸，边缘整齐，乳白色，半透明或不透明。革兰染色菌体呈红色短杆状，表明此菌为革兰阴性菌(图1)。葡萄糖、果糖、β-半乳糖苷(ONPG)、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、蛋白胨水(靛基质)、DNA、硝酸盐(还原)、丙二酸盐、醋酸盐、甘露醇、黏液酸、乙酰胺、明胶液化阳性；木糖、阿拉伯糖、枸橼酸盐、尿素均呈阴性。综合形态学观察和生理生化结果分析发现分离菌株与《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》[22]中霍氏肠杆菌的描述基本一致，初步鉴定为霍氏肠杆菌，并命名为ztl-01。经16S rDNA基因扩增并测序，获得长度为1 458 bp 的片段(图2)(GenBank:MN880393)，并建立系统进化树(图3)。综合判定ztl-01为霍氏肠杆菌。

图1 革兰染色结果(1 000×)

M.DL2000 DNA Marker;1.16S rDNA基因扩增;2.阴性对照

图3 系统发育树

2.2 毒力因子检测对ztl-01进行毒力基因PCR扩增检测出毒力基因cpa、fimH(图4)，其单一条带与预期大小一致，其他6种毒力基因ompX、hly、sip、afa、papA、papC均未检出。

2.3 致病性试验攻毒后12 h,15只试验组小鼠其中12只出现身体发抖、体温升高的症状,并在24 h后出现腹式呼吸、腹泻，48 h后试验组3只腹泻小鼠死亡；剩余3只小鼠无临床症状。对照组小鼠也无临床症状。试验组小鼠的肠、肝脏、肾脏、脾脏均出现病变：肠黏膜水肿、绒毛缩短、部分上皮细胞坏死脱落，淋巴细胞浸润，空肠和盲肠绒毛断裂明显，十二指肠和空肠充血明显，回肠淋巴细胞浸润；肝小叶失去正常结构，肝细胞变性，肝窦充血；肾小管上皮细胞变性，管腔狭窄；脾脏脾髓中红髓区域中红细胞增多，脾小体减少(图5)。

M.DL2000 DNA Marker;1.cpa;2.fimH

A.肝窦充血；B.脾髓中红髓区域中红细胞增多； C.十二指肠充血；D.空肠绒毛断裂、充血；E.回肠淋巴细胞浸润；F.盲肠绒毛断裂

2.4 动物回归试验试验组3只山羊接种后24 h均出现体温升高、精神沉郁、厌食和伴随轻微腹泻症状，连续观察到7 d无其他病症出现，而对照组山羊在观察期内正常。无菌采集试验组山羊的粪便进行细菌分离纯化，再次分离鉴定出霍氏肠杆菌，表明该菌株对山羊有一定的致病性。

2.5 耐药基因检测耐药基因TEM、aph(3′)-Ⅱa、Sul1的检测结果与其PCR产物测序结果一致(图6)，而耐药基因aac(3)-Ⅱa、aac(6′)-Ⅰb、ant(3′′)-Ⅰa、Sul2、Sul3均未被检出。

2.6 药物敏感性结果显示，ztl-01对阿莫西林、氨曲南、头孢他啶、头孢哌酮、头孢曲松、阿米卡星、头孢唑啉、头孢噻肟、磷霉素、拉氧头孢、氧氟沙星、甲氧苄啶、庆大霉素敏感；对美洛西林、卡那霉素、多西环素中度敏感；对妥布霉素、氨苄西林/棒酸、磺胺甲基异恶唑、环丙沙星、氨苄青/舒巴坦、链霉素、诺氟沙星、氯唑青霉素、林可霉素、青霉素、克林霉素、氟苯尼考、红霉素、麦迪霉素不敏感。磺胺类和氨基糖苷类耐药基因检测结果与耐药表型结果基本一致，而β-内酰胺类大多不一致(表1)。

M.DL2000 DNA Marker；1.TEM；2.aph(3′)-Ⅱa；3.Sul1

表1 药敏试验结果

2.7 生物被膜检测试管法检测到该分离菌具有形成生物被膜的能力，微孔板法检测分离菌株生物被膜形成能力强弱，按照判定标准，此菌D/ODC值为1.43，ODC

不同质量浓度NaCl对霍氏肠杆菌的生物被膜形成具有促进作用，并且随着培养基中NaCl质量浓度的增加，细菌的成膜能力增加(图7)，表明NaCl质量浓度对此菌成膜能力的促进作用呈正相关。

图7 NaCl质量浓度对霍氏肠杆菌生物被膜的影响结果(n=3)

3 讨论

目前，关于霍氏肠杆菌的分离鉴定报道较少，O’HARA 等[4]从病人的血液、伤口和痰液分离到与阴沟肠杆菌和溶解肠杆菌亲缘关系最近的霍氏肠杆菌。在国内从1例脑卒患者痰液中分离鉴定到1株霍氏肠杆菌[11]。DAPHNE等[7]从海龟左腕关节滑液中分离到霍氏肠杆菌。李璐瑶等[3]从腹泻仔猪粪便中分离到1株霍氏肠杆菌。温珊珊等[2]从发病狐狸的子宫内脓液中分离到霍氏肠杆菌，16S rDNA片段长度约为1 500 bp，能发酵木糖、甘露醇等。程建国等[10]从患肺炎的林麝肺部病料中运用常规鉴定和16S rDNA PCR方法分离鉴定到16S rDNA片段长度约为1 600 bp的霍氏肠杆菌。本试验从四川某养殖场的腹泻山羊粪便中分离鉴定1株霍氏肠杆菌菌株ztl-01。菌株ztl-01不能发酵木糖，能发酵甘露醇，与以上报道结果有差异，可能由于菌株来源环境与分离条件不同，并提示霍氏肠杆菌的分布环境广泛。

目前，霍氏肠杆菌对人和动物均具有一定的致病性。霍氏肠杆菌可引起人体血液感染(BSIs)[23-25]。霍氏肠杆菌能导致断奶小牛呼吸道感染并死亡，肺组织肺泡隔膜周围的红细胞渗血和隔膜增厚，炎性细胞浸润[5]。霍氏肠杆菌是野生与圈养海龟的重要病原体[7]。霍氏肠杆菌也可能导致狐狸的化脓性子宫内膜炎[2]和林麝肺炎[10]。从病犬、猫[26]分离的大肠杆菌携带的黏附相关毒力因子fimH主要引起其尿路感染，在同属的坂崎肠杆菌中，血浆纤溶酶原激活物基因cpa与该菌的传播和侵入相关[27]。本试验检测到霍氏肠杆菌cpa、fimH毒力因子，推测与此菌的传播和感染相关，该菌对小鼠具有一定致病性，与上述报道的致病性研究结果相似，消化道与肝脏为主要病变器官。此菌对山羊具有一定致病性，主要导致体温升高、腹泻等，从而推测此菌的感染可以引起山羊腹泻。至今尚未发现霍氏肠杆菌感染与山羊腹泻有关的报道，本研究结果提示该菌有更广泛的宿主范围。

细菌生物被膜是细菌为适应外界环境，自身产生的胞外多聚物基质包裹的膜状细菌群体，能增强细菌的耐药性，导致反复细菌性感染，大约85%的细菌性疾病与生物被膜形成有关[28-30]。香草酸可作为有潜力的治疗霍氏肠杆菌感染药物[31]。本试验中菌株ztl-01能形成生物被膜，属于弱黏着菌株，说明该菌对抗生素和机体免疫系统具有一定的耐受性[32]。该菌株对14种抗生素耐药，磺胺类和氨基糖苷类耐药基因检测结果与耐药表型结果大体一致，而β-内酰胺类大多不一致。这与O’HARA等[4]分离出来的菌株耐药表型大部分相同。从小牛肺组织和鼻分泌物中分离的霍氏肠杆菌对喹诺酮类药物具有敏感性[5]，而本研究中此菌对环丙沙星和诺氟沙星耐药，对氧氟沙星敏感。与李璐瑶等[3]的药敏结果也存在部分差异，前者对头孢曲松、氨曲南、头孢他啶具有耐药性，而本研究中此菌对这些抗生素敏感。这些耐药表型差异可能是由于细菌的宿主、环境、用药情况不同而异，启示应选择合适有效的抗生素治疗感染动物。

本试验从腹泻山羊粪便中分离到1株具有致病性和耐药性的霍氏肠杆菌，可以轮换使用拉氧头孢、氧氟沙星、阿米卡星等敏感抗生素进行防控。