提金凤，李志杰，刁有祥，李 舫*

(1.山东畜牧兽医职业学院，山东 潍坊 261061；2.山东农业大学 动物科技学院，山东 泰安 271018)

坦布苏病毒(Tembusu virus，TMUV)感染是近年来我国新出现的一种以水禽感染为主的病毒性传染病。雏鸭感染后表现为行动迟缓、瘫痪、倒地震颤等症状，产蛋鸭感染后表现为产蛋率下降，卵泡出血、破裂、形成卵黄性腹膜炎等特征，给水禽养殖业带来了巨大的经济损失[1-2]。TMUV最早是1955年从蚊子体内分离到的，其属于黄病毒科、黄病毒属、那他耶病毒群中的蚊媒类病毒[3-4]。黄病毒属中大多数病毒属于人兽共患病毒，如登革热病毒(DENV)、流行性乙型脑炎病毒(JEV)、黄热病毒(YFV)、西尼罗病毒(WNV)等，每年都会有数百万人感染或死亡的病例报道，严重威胁着全世界人类的健康[5-6]。

细胞凋亡(apoptosis)是生物体重要的生理和病理现象，凋亡规律一旦失常，机体将出现病理现象[7-10]。邵周伍林等[11]研究发现，TMUV E蛋白在鸭胚成纤维细胞(DEF)表达过程中具有诱导宿主细胞发生凋亡的作用。据报道，BALB/c小鼠、昆明鼠均能通过脑内途径接种感染TMUV，表现出明显的临床症状和病变[3,11]。TMUV还能引发BALB/c小鼠发生抗体依赖性感染[3]。为探讨TMUV能否诱导哺乳动物细胞发生凋亡，本研究以昆明鼠作为实验动物，采用不同检测方法研究昆明鼠感染TMUV后诱导脾细胞凋亡的作用，初步探讨TMUV与哺乳动物细胞的相互作用，进一步了解病毒的致病机制，为有效防制该病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及病毒3周龄雌性SPF级昆明鼠购自山东省实验动物中心。鸭TMUV SDSG株由山东农业大学禽病研究所分离保存，该毒株为2013年从山东省某发病养鸭场的病死鸭体内分离(KJ740746)获得。试验组昆明鼠病毒的接种剂量为104.8ELD50/0.2 mL(ELD50：鸡胚半数致死量)。

1.2 试剂细胞凋亡-DNA Ladder抽提试剂盒、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒均购自碧云天生物技术有限公司；100 bp DNA Ladder购自天根生化科技有限公司；琼脂糖购自Sigma公司；高糖型DMEM购自海克隆公司；无支原体胎牛血清购自北京全士金生物技术有限公司；青/链霉素混合液(100×)购自北京索莱宝科技有限公司；细胞培养瓶、细胞培养板购自美国康宁公司(Corning)；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 体内试验30只3周龄雌性SPF级昆明鼠随机分成2组，每组15只。其中试验组采用脑内(I.c)途径接种50 μL TMUV-SDSG病毒液(104.8ELD50/0.2 mL)，该接种剂量是通过预试验确定的。阴性对照组于相同途径接种50 μL无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)，每天观察小鼠临床症状。分别于攻毒后3，5，7 d，每组随机选择5只小鼠安乐死，收集脾脏组织。据文献报道[3,12]，TMUV只有通过脑内接种才能感染昆明鼠，昆明鼠感染后，脾脏是病变最明显的组织器官，病毒载量高，因此本研究选择脾细胞作为研究细胞凋亡的靶器官。

1.3.1DNA Ladder法检测细胞凋亡 首先进行组织DNA的提取。将脾脏组织剪切成小块，研钵中研碎或捣碎，按照细胞凋亡-DNA Ladder抽提试剂盒说明书的要求加入适量的样品裂解液，每毫升样品裂解液应加入5 μL蛋白酶K，Vortex旋涡混匀器混匀，充分裂解组织。50℃水浴消化过夜12～20 h。加入500 μL Tris平衡苯酚(pH 8.0)，Vortex旋涡混匀器剧烈混匀，使有机相和水相充分混合，以达到抽提效果。4℃、12 000 r/min离心5 min。缓慢吸取上层水相，并用等体积Tris平衡酚再抽提1次。缓慢吸取约300 μL上清液，加入60 μL 10 mol/L 醋酸铵和600 μL无水乙醇，颠倒数次混匀，此时可见DNA沉淀产生。-20℃ 作用 1 h，以充分沉淀小片段DNA。-20℃过夜或-70℃ 作用效果更佳。4℃、12 000 r/min 离心10 min，弃上清。加入600 μL 70%乙醇，缓慢颠倒约2次。4℃、12 000 r/min 离心10 min，小心吸去上清。尽量除去残余的乙醇，待看不到明显的液体时，立即加入50～100 μL TE溶解DNA。

其次进行琼脂糖凝胶电泳。取部分抽提的脾脏DNA，进行1%琼脂糖凝胶电泳。电泳电压采用50 V，电泳时间持续2 h左右。制胶时选取较薄的梳齿，加样孔扁平，这样会获得更好的DNA Ladder电泳效果。

1.3.2采用流式细胞仪检测细胞凋亡 无菌采集攻毒3，5，7 d后昆明鼠的脾脏，研磨后获取脾细胞，红细胞裂解液处理后，脾细胞采用1 000 r/min离心5 min，弃上清，用PBS重悬细胞并计数。取(5～10)×104重悬细胞，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入195 μL Annexin V-FITC结合液，重悬细胞。加入5 μL Annexin V-FITC，轻轻混匀，然后加入10 μL PI染色液，混匀，室温(20～25℃)避光孵育10～20 min，随后置于冰浴中。避光孵育过程中可重悬细胞2～3次，以改善染色效果。染色后，立即上流式细胞仪进行检测。同时设置未染色组、PI单染组和Annexin V-FITC单染组作为对照。

无菌采集阴性对照组昆明鼠的脾脏，处理方法同上。

1.4 体外试验无菌采集3周龄SPF昆明鼠的脾细胞，红细胞裂解液处理后，用含10%小牛血清的1640细胞培养基悬浮，接种于24孔细胞板中，置于37℃细胞培养箱中进行培养。脾细胞培养24 h后，每孔接种0.2 mL TMUV-SDSG，病毒吸附1 h后，弃掉细胞上清，加入含10%小牛血清的1640细胞培养基继续培养。同时设立未接种TMUV的脾细胞作为阴性对照组。

1.4.1流式细胞仪检测细胞凋亡 分别收集接种TMUV-SDSG后继续培养24，48 h的脾细胞，1 000 r/min离心5 min，弃上清，PBS重悬细胞并计数。取(5～10)×104重悬细胞，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入195 μL Annexin V-FITC结合液，重悬细胞，然后加入5 μL Annexin V-FITC，轻轻混匀。加入10 μL PI染色液，混匀，室温(20～25℃)避光孵育10～20 min，随后置于冰浴中。避光孵育过程中可重悬细胞2～3次，以改善染色效果。染色后，立即上流式细胞仪进行检测。Annexin V-FITC染色后为绿色荧光，PI染色后为红色荧光。同时设立未染色组、PI单染组和Annexin V-FITC单染组作为对照。

由于脾细胞培养72 h后，死亡细胞数目过多，因此只收集了24，48 h的脾细胞进行检测。

1.4.2荧光显微镜观察细胞凋亡 脾细胞经Annexin V-FITC和PI染色后，1 000 r/min离心5 min，弃上清，用50～100 μL Annexin V-FITC结合液重悬细胞，细胞涂片，荧光显微镜下观察。设立未染色组和PI单染组作为对照。

1.5 数据分析流式细胞仪检测脾细胞凋亡时，每个时间点均选择5个攻毒样本和5个对照样本进行检测，每个样本均检测3次。检测结果运用软件Graph Prism进行分析，方法采用单向方差分析法即Tukey's post-test法(差异显著：P<0.05；差异极显著：P<0.01)。

2 结果

2.1 体内试验

2.1.1DNA Ladder法检测细胞凋亡 分别取攻毒TMUV-SDSG后3，5，7 d昆明鼠的脾脏，DNA ladder试剂盒处理后进行1%琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图1所示。昆明鼠攻毒后3 d，脾脏组织没有出现DNA Ladder图谱，攻毒后5，7 d，脾脏组织出现了明显的梯状DNA Ladder图谱。阴性对照组均没有出现DNA Ladder图谱。

M.100 bp DNA Marker ；1～3.攻毒后3，5，7 d昆明鼠脾脏DNA Ladder；4～6.阴性对照组小鼠脾脏DNA Ladder

2.1.2流式细胞仪检测细胞凋亡 无菌采集攻毒后3，5，7 d昆明鼠的脾细胞，红细胞裂解液处理后，Annexin V-FITC和PI染色，流式细胞仪检测凋亡细胞，结果如图2所示。

昆明鼠攻毒TMUV后3 d，脾细胞中凋亡细胞比例为49.30%(图2A)，对照组健康昆明鼠脾细胞中凋亡细胞比例为36.44%(图2B)，攻毒组与对照组差异显著(图2G，P<0.05)。昆明鼠攻毒TMUV后5 d，脾细胞中凋亡细胞比例为53.76%(图2C),对照组健康昆明鼠脾细胞中凋亡细胞比例为43.84%(图2D)，攻毒组与对照组差异显著(图2G，P<0.05)。昆明鼠攻毒TMUV后7 d，脾细胞中凋亡细胞比例为68.62%(图2E),对照组健康昆明鼠脾细胞中凋亡细胞比例为31.72%(图2F)，攻毒组与对照组差异极显著(图2G，P<0.01)。

A,C,E.分别为昆明鼠感染TMUV后3，5，7 d的脾细胞凋亡细胞比例；B,D,F.分别为对照组健康昆明鼠脾细胞凋亡细胞比例；G.凋亡细胞的比例,误差线表示样本平均数的标准偏差(n=3)，a与b表示不同时间点攻毒组和对照组统计学差异显著(P<0.05，P<0.01)，计算采用单向方差分析法(Tukey's post-test)。下同

2.2 体外试验

2.2.1流式细胞仪检测细胞凋亡 分别收集接种TMUV后24，48 h昆明鼠的脾细胞，染色后，流式细胞仪检测凋亡细胞，以健康昆明鼠的脾细胞作为对照。结果如图3所示，感染TMUV后24 h的昆明鼠脾细胞中，凋亡细胞比例为27.9%(图3A)，对照组昆明鼠脾细胞中凋亡细胞比例为16.1%(图3B),试验组和对照组相比差异显著(图3E，P<0.05)。感染TMUV后48 h的昆明鼠脾细胞中，凋亡细胞的比例为32.22%(图3C),对照组昆明鼠脾细胞中凋亡细胞比例为25.26%(图3D),试验组和对照组相比差异显著(图3E，P<0.05)。

A，C.对照组脾细胞培养后24，48 h凋亡细胞的比例；B，D.脾细胞感染后TMUV 24，48 h凋亡细胞的比例；E.凋亡细胞的比例

2.2.2荧光显微镜观察细胞凋亡 脾细胞经Annexin V-FITC和PI染色后，荧光显微镜下观察，结果显示，绿色荧光染色的为凋亡细胞，绿色和红色荧光双染色的是坏死细胞；其中脾细胞感染TMUV后48 h，凋亡细胞数目和死亡细胞数目比24 h更多。未染色对照组，没有出现任何荧光(图4)。

3 讨论

TMUV最早在我国出现时，只有鸭感染发病，不到1年时间，该病毒迅速蔓延至鹅、鸡和鸟类，可见该病毒传播速度快，易感动物种类多。TMUV感染后主要引起产蛋禽的产蛋率下降，幼禽的神经症状等[13-15]。研究表明，TMUV感染蛋鸡和鹅时，感染细胞短时间内便会发生细胞凋亡[16]。随着TMUV不断进化，可能会有更多种类的动物被感染，如哺乳动物等。关于TMUV与哺乳动物细胞之间相互作用的研究较少，诱导哺乳动物细胞凋亡的研究还尚未见报道。但黄病毒属中其他病毒诱导宿主细胞凋亡的研究较多，如DENV、JEV、猪瘟病毒(CSFV)等。据报道，DENV能诱导人的血管内皮细胞发生凋亡，而且该凋亡与细胞受体Fas/FasL的表达改变有关[17-19]。本研究通过TMUV体内和体外2种方式感染昆明鼠脾细胞，观察流式细胞仪和DNA Ladder的检测结果，进一步评估该病毒诱导昆明鼠脾细胞的细胞凋亡作用。

A,E.脾细胞感染TMUV 24，48 h Annexin V-FITC染色结果；B,F.脾细胞感染TMUV 24，48 h PI染色结果；C,G.脾细胞感染TMUV 24，48 h Annexin V-FITC和PI染色后融合的结果；D,H.脾细胞感染TMUV 24，48 h未染色对照组

本研究的体内试验是采用脑内接种途径对昆明鼠进行攻毒后，对脾细胞凋亡情况进行检测。DNA Ladder法检测结果显示，昆明鼠攻毒后3 d，脾脏组织没有出现梯状DNA Ladder，攻毒后5,7 d，脾脏组织出现了特异性的梯状DNA Ladder图谱。流式细胞仪检测结果显示，昆明鼠攻毒后3 d，脾细胞中凋亡细胞比例与对照组相比差异显著；攻毒后5，7 d，脾细胞中凋亡细胞比例与对照组相比差异极显著。这些数据充分表明，TMUV能够诱导昆明鼠脾细胞发生凋亡。TMUV感染初期，细胞凋亡不明显，感染时间延长，细胞凋亡越显著。这与昆明鼠感染TMUV后发生病理变化和免疫抑制的规律是一致的[1]，从而进一步说明TMUV诱导昆明鼠脾细胞凋亡可能是导致脾脏病变及机体免疫抑制的重要因素之一。

据报道，CSFV的E蛋白与淋巴细胞孵育后，能抑制淋巴细胞蛋白质的合成和诱导细胞凋亡[20]。SATO等[21]经体外研究也证明了CSFV可以在脾组织细胞引起细胞凋亡[22]。JEV可以诱导小鼠发生明显的细胞凋亡。本研究中，TMUV也表现出相似的特性。TMUV能诱导体外培养的昆明鼠脾细胞发生显著的细胞凋亡。体外试验中，脾细胞感染TMUV继续培养，培养72 h，死亡脾细胞占绝大多数，因此本研究只选择了2个时间点，即24，48 h进行检测。流式细胞仪对Annexin V-FITC和PI染色后的脾细胞进行检测，结果表明，TMUV感染24，48 h，凋亡细胞比例与对照组相比差异显著，病毒感染时间延长，凋亡细胞的比例越显著。这与体内试验结果一致。荧光显微镜观察V-FITC和PI染色后的脾细胞，结果显示，TMUV感染24，48 h，均出现多量凋亡细胞，病毒感染时间与凋亡细胞比例的关系与前面试验的结果一致。

本研究通过体内和体外试验明确了TMUV感染昆明鼠后能诱导脾细胞发生显著的细胞凋亡，为探讨TMUV与易感动物细胞的作用机制、揭示其致病原理奠定了基础，为有效防制该病提供了理论依据。