隗陈征,刘鹰,任纪龙,马洪婧,吴英海,韩蕊*

(1.大连海洋大学 海洋科技与环境学院，辽宁 大连 116023；2.设施渔业教育部重点实验室，辽宁 大连 116023)

将铁基填料引入BAF中形成铁-氮循环进而促进氮转化被认为可以有效提高系统脱氮效率[8]。铁循环和氮循环因互为电子供体和受体，可以通过生物作用和非生物作用耦合。海绵铁填料引入水处理系统可通过吸附固定好氧、兼性厌氧和厌氧等细菌形成生物海绵铁，并利用其特殊的化学性能增强系统脱氮性能。李杰等[9]通过将传统活性污泥法中的填料替换为海绵铁形成了生物海绵铁体系，提高了系统的脱氮除磷能力。匡颖等[10]在海绵铁与火山岩填料A/O生物滴滤池脱氮除磷试验中研究证明，海绵体的引入提高了滴滤池的脱氮除磷能力。目前，已有对铁-氮耦合的微生物机理研究，但其中多为针对自然环境和生活污水的处理研究[11-14]，而针对循环海水养殖废水处理的研究较少。因此，通过对BAF中填料生物膜细菌群落进行扩增子测序，并对群落结构进行解析，揭示反应器细菌群落结构从而解析系统脱氮内在机理[15-16]，并定向调控脱氮功能细菌群落，对于降低养殖水体中氮素积累具有非常重要的意义。

本研究中，以生物海绵铁与PPC凝胶亲水填料形成复合填料，设置了不同曝气运行方式，并通过16S rDNA高通量测序，研究了不同曝气方式下不同填料上的细菌群落结构、丰度和多样性等，探究了不同曝气运行方式下系统脱氮性能及细菌群落变化，以期通过优化曝气运行方式解析脱氮相关的细菌群落结构，提高BAF系统的脱氮性能。

1 材料与方法

1.1 材料

试验装置如图1所示，试验用BAF为圆柱形(直径10 cm、高60 cm)，有机玻璃材质，在BAF底部安装有布水板以支撑填料和均匀布水。采用海绵铁(购自河南希尧环保科技有限公司，粒径0.5～5.0 mm，含铁量大于95%)与PPC凝胶填料作为复合填料，海绵铁与PPC凝胶填料配比为1∶3(质量比)，并使两种填料混合均匀，用网兜固定，每个反应柱内填料总质量为900 g。通过时间控制器(AL-06，小耳朵电子科技有限公司)控制间歇曝气时长，其中，柱A连续曝气24 h，柱B曝气12 h，间歇12 h，柱C曝气0 h，系统进水为上流式，通过高位水箱进入系统。系统运行温度通过加热棒控制在(30.0±0.5)℃，水力负荷率(HLR)通过蠕动泵调控在1.2 m3/(m2·d)，碳氮比(C/N)为3∶1，pH为7.0±0.5。

A—24 h连续曝气； B—12 h间歇曝气； C—0 h曝气； 1—海绵铁与PPC复合填料； 2—溢流口； 3—高位水箱； 4—蓄水池； 5—蠕动泵； 6—气石； 7—取样口。

1.2 方法

1.2.2 试验设计及取样 待系统运行稳定后，从反应器最上方取样口进行取样。每次用50 mL的无菌离心管收集水样50 mL。待系统稳定运行20 d后，在无菌条件下，分别将3个生物滤器中复合填料的海绵铁和PPC凝胶填料手动分离，分别用无菌离心管收集，编号A1、A2、A3分别为曝气24、12、0 h的海绵铁填料，B1、B2、B3分别为曝气24、12、0 h 的PPC凝胶亲水填料，每个填料组设3个重复，取各组填料样品置于-80 ℃超低温冰箱中保存，用于微生物群落结构测定。

η=(ρ1-ρ2)/ρ1×100%。

1.2.4 DNA提取和16S rDNA高通量测序 采用十六烷基三甲基溴化铵法对样本的基因组DNA进行提取，检测DNA的纯度和浓度，取适量的样本DNA于离心管中，使用无菌水稀释样本至1 ng/μL。以稀释后的基因组DNA为模板，采用16S V4区引物(515F 和806R)，使用带Barcode的特异引物进行PCR扩增。高通量测序工作委托北京诺禾致源科技股份有限公司完成。

1.3 数据处理

基于Illumina Nova测序平台测序，构建PCR-free文库，然后进行双末端测序。每个样品设3个重复，通过对Reads拼接，平均每个样品测得93 314条tags，经过质控平均得到87 852条有效数据，质控有效数据量达64 631，质控有效率达70%。以97%的一致性将序列聚类成为OTUs(operational taxonomic units)，进行聚类时，先将序列按照丰度从大到小排序，通过97%相似度的标准聚类，得到16S rDNA OTU，每个OTU被认为可代表一个细菌物种(微生物物种)[18]。试验中共得到5 353个OTUs，然后对OTUs序列与Silva132数据库进行物种注释，注释结果中，共有2 009(38%)个OTUs注释到属水平。通过对不同样本在97%一致性阈值下的Alpha diversity 分析指数(Shannon、Chao1、ACE和good_coverage)进行统计。通过多变量统计学方法(unweighted unifrac)对距离进行主坐标分析PCoA(principal co-ordinates analysis)。基于unweighted unifrac 距离绘制热图用来评估微生物样品组间的物种差异程度。

2 结果与分析

2.1 不同曝气处理下的水质测定

图2 不同曝气处理下的去除率

图3 不同曝气处理下的质量浓度

2.2 16S rRNA高通量测序

2.2.1 细菌群落组成 从图4可见：各处理组均是变形菌门Proteobacteria为优势菌群，其相对含量约占总细菌组成的52.1%～80.1%，其次是厚壁菌门Fermicutes、拟杆菌门Bacteroidetes，分别占23.3%～0.9%、11.4%～0.1%，其他相对丰度较少的细菌属为放线菌门Actinobacteria、绿弯菌门Chloroflexi、硝化螺旋菌门Nitrospirae、浮霉菌门Planctomycetes等；A2组微生物组成与其他组差异较大，其变形菌门相对丰度最少，为52.1%，而厚壁菌门和变形杆菌门相对丰度最多，分别为23.3%和11.4%，芽孢杆菌纲Bacilli(10.3%)和梭菌纲Clostridia(11.4%)相对丰度均高于其他处理组；而与A2组在同一个反应器的B2组，变形菌门(80.1%)与γ-变形菌纲γ-Proteobacteria相对丰度均最多。

图4 各处理组门水平和纲水平微生物组成

从图5可见：在属水平上，不同曝气方式的细菌群落组成差异较大；A1组中亚硝化螺菌属Nitrosospira相对丰度较大(6.6%)，A2组中的不动杆菌属Acinetobacter(1.7%)、拟杆菌属Bacteroides(6.9%)、代尔夫特菌属Delftia(1.9%)和兼性厌氧的葡萄球菌属Staphylococcus(5.3%)相对丰度均高于其他处理组，B2组中发光杆菌属Photobacterium为优势菌属(相对丰度62%)；弧菌属Vibrio在B3和B1组中大量存在(相对丰度分别为11.7%和10.5%)，而在A2和B2组中含量较低(分别为2.8%和4.8%)。

图5 各处理组属水平微生物组成

2.2.2 微生物丰度和多样性结果 Alpha多样性分析结果如表1所示，其中覆盖率均在0.99以上，说明样品文库覆盖率高，数据可靠，而A2组平均Shannon、Chao1和ACE指数均最大，平均值分别为7.44、2 396和2 484。

表1 0、12、24 h曝气处理微生物的Alpha多样性指数

从图6(a)可见，第一、第二主成分对样本差异的贡献率分别为16.78%、12.37%，对于各样本微生物群落构成的累计贡献率为29.15%，A1组与B1组，A2组与B2组，A3组与B3组间存在较大差异。从图6(b)可见：对于BAF的海绵铁处理而言，A2组与A3组差异最大，相异系数为0.360，其次是A2组与A1组，相异系数为0.274；对于PPC填料处理，B1组与B3组差异最大，相异系数为0.145。

图6 各处理组的Beta多样性PCoA图和矩阵距离热图

所有处理组共同拥有OTUs为1 106，占OTUs总数的49.1%，A2组特有OTUs数量为345，高于其他处理组(图7(a))；海绵铁填料处理组共同拥有OTUs为1 558，A2组特有OTUs数量最高为888，远高于其他两个处理组(图7(b))；PPC填料共同拥有OTUs为1 487，B1处理组特有OTUs数量最高，为560(图7(c))；海绵铁填料处理组共同拥有OTUs数高于PPC填料处理。

图7 总体韦恩图、海绵铁填料韦恩图和PPC填料韦恩图

3 讨论

3.1 系统脱氮性能分析

3.2 曝气生物滤器细菌群落结构分析

本研究表明，在门和纲水平上，不同间歇运行方式下海绵铁填料和PPC填料细菌群落组成均存在差异，这说明不同的曝气运行方式和填料类型均影响系统细菌群落组成，从而导致各处理组脱氮效果的差异。在不同填料细菌群落结构方面，海绵铁填料处理组的厚壁菌门及芽孢杆菌纲相对丰度均高于PPC填料处理组，这说明海绵铁填料结构更适宜好氧或兼性厌氧的厚壁菌门细菌生长。PPC填料处理组浮霉菌门和变形菌门相对丰度均高于海绵铁填料处理组。目前，已知的厌氧氨氧化菌都属于浮霉菌门，说明PPC填料表面更易富集厌氧氨氧化菌，对系统中氨氮转化为氮气并从系统中脱出起到关键作用[21]。本研究中，生物海绵铁填料处理组的γ-变形菌纲含量均低于PPC填料处理组，以往研究也表明，大量好氧和兼性厌氧细菌属于γ-变形菌纲，均为既能进行呼吸代谢又能进行发酵代谢的兼性异氧菌[3,22]，这说明铁基填料会抑制γ-变形菌纲菌属的富集。因此，海绵铁和PPC填料形成的复合填料能够富集广谱脱氮相关的细菌群落，从而提高系统脱氮性能。

本研究表明，在属水平上，不同间歇运行方式的细菌群落组成差异较大，其中，A2和B2组细菌属水平组成与其他组存在较大差异(图5)。A2组中大量存在的拟杆菌属为污水处理中活性污泥的常见优势属，田道贺等[27]在研究硝化型生物絮团的驯化培养中发现，经过驯化拟杆菌属成为硝化型生物絮团的优势菌属，其与硝化作用密切相关，进一步证明12 h间歇曝气处理具有较强的硝化作用。A2组中相对丰度较多的不动杆菌属[28]和代尔夫特菌属也包含了部分好氧反硝化菌，其中，代尔夫特菌属中的部分菌种具有良好的好氧反硝化能力[29]。兼性厌氧的葡萄球菌属在A2组中相对丰度也较高，该属中部分菌种属于反硝化聚磷菌，通常具有良好的反硝化性能[30-31]。在B2组中发光杆菌属为优势菌属(相对丰度为62%)，研究表明，该菌属菌株能生长在含海水、D-葡萄糖和NH4Cl的无机培养基中，是一种兼性厌氧的化能异养菌，该属部分菌株属于好氧反硝化菌[32]。

综上所述，12 h间歇曝气运行条件使得系统能够富集兼性厌氧及好氧脱氮功能菌，这是12 h间歇曝气处理具有良好脱氮能力的原因之一。

3.3 组间共有及特有OTU分析

本研究表明，A2组OTUs数目最高，说明A2组的微生物多样性高于其他组，这说明在间歇曝气条件下营造出有氧-缺氧甚至厌氧的环境条件，适宜富集更广氧气耐受范围的微生物群落。生物海绵铁填料微生物多样性高于PPC填料(图7(a))，因为海绵铁本身具有一定的除氧作用，可在系统中为各种好氧、兼氧和厌氧微生物的协同共生提供良好的“微环境”，在整个复合填料中，生物海绵铁填料上的微生物是导致3个试验组脱氮效果差异的主要微生物因素。A2组特有OTUs远高于其他处理，进一步说明该处理组微生物多样性最高，说明12 h间歇曝气对海绵铁填料上的微生物多样性有利。在PPC填料处理中，B1组OTUs高于B2、B3组，这说明曝气24 h处理在PPC填料上的微生物多样性高于其他两种曝气运行方式，推测是由于PPC填料虽然与海绵铁填料混合，但仍不会达到完全混合均匀的状态，故在PPC填料内部的铁离子远远少于海绵铁填料上的铁离子，所以PPC填料上的铁氧化菌和铁还原菌的数量小于海绵铁填料，此时24 h连续曝气对硝化作用的加强效果要比铁-氮循环对微生物多样性的促进效果强，导致B1组的生物多样性高于B2组[33]。

3.4 微生物丰度和多样性分析

3.4.1 Alpha多样性分析 群落生态学中，通过样品的多样性分析(Alpha 多样性)，可以反映微生物群落的丰度和多样性[34]。根据测序公司提供的报告，Shannon指数值越大，说明群落多样性越高[7,24]。本研究中，A2组Shannon指数最高，这说明A2组的群落多样性最高，与群落结构分析结果一致。Chao1指数和ACE指数反映微生物群落丰度，Chao1和ACE指数数值越大，表明样本物种丰度越大。本研究中，A2组Chao1和ACE指数均最大(表1)。其原因可能是由于12 h曝气处理通过间歇曝气的方法在不同时段分别强化了硝化反应和反硝化反应，研究表明，与铁-氮循环相关的铁氧化菌和铁还原菌的生长多伴随着反硝化反应[35]，所以A2组的环境适合铁氧化菌和铁还原菌的生长，故12 h曝气处理组中的细菌群落丰度和多样性要高于24 h曝气处理组。

4 结论

2)通过12 h间歇曝气处理可改变生物滤器的内部环境，形成良好的好氧-缺氧交替环境，明显提高了填料微生物多样性，其中，海绵铁填料上具备反硝化能力的不动杆菌属Acinetobacter和代尔夫特菌属Delftia，以及PPC填料上的发光杆菌属Photobacterium相对丰度均有所提高，这些菌属通过强化反硝化过程提升了系统整体脱氮性能。

3)由于铁基填料的引入，在间歇曝气条件下促进了铁-氮耦合过程，使海绵铁和PPC凝胶复合填料上富集了更多的反硝化菌，这是12 h间歇曝气处理脱氮性能提升的原因之一。但是关于系统中铁氧化还原调控氮转化的机制仍需进一步研究。