孟少东，姜新宇，葛恒，胡光耀，杨大佐，张家林* ，李强

(1.大连海洋大学 农业农村部北方海水增养殖重点实验室，辽宁 大连 116023； 2.盐城工学院 海洋与生物工程学院，江苏 盐城 224051)

鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2)是引起鲫造血器官坏死症的病原，具有较强的致病性[1]。流行病学表明，CyHV-2感染后会引发鲫出现体表、鳃出血，内脏肿大出血[2]，鳔、下颌多处充血，眼球突出，眼球基部充血等症状[3]，对1龄幼鱼具有强烈的致病性，严重威胁中国鲫养殖业的健康发展。然而，迄今尚缺少有效控制该病暴发的措施，对其发病机制也缺乏了解。

为逃避宿主的免疫攻击，病毒在长期进化过程中，发展出多种免疫逃逸策略阻断宿主免疫应答。其中，疱疹病毒等大分子DNA病毒，能通过编码一些宿主细胞免疫调节蛋白类似物(如干扰素受体类似物、白介素类似物、肿瘤坏死因子受体类似物等)干扰宿主的免疫应答，从而逃逸宿主的免疫清除[4]，这一类病毒编码蛋白也被称为病毒编码受体(viroceptor)，其作用主要是阻断和抑制细胞因子与其受体结合，从而抑制宿主细胞的免疫反应[5]。研究发现，一些DNA病毒可编码TNFR类似物(vTNFR)进而参与病毒的复制过程，目前，兔纤维瘤病毒(Shope fibroma virus, SFV)[6]、新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus, SGIV)[7-8]和鲤疱疹病毒Ⅲ型(Cyprinid herpesvirus 3, CyHV-3)等[9-10]均有相关报道。

CyHV-2病毒隶属于疱疹病毒目Herpesvirales鱼疱疹病毒科Alloherpesviridae鲤疱疹病毒属Cyprinivirus[11]。该病毒最早于1992年在患病金鱼上发现，由于其是从鲤科鱼类分离的第二种疱疹病毒，故被命名为鲤疱疹病毒Ⅱ型。在结构方面，CyHV-2病毒具有鱼类疱疹病毒的一般特征，病毒是一种较大的线性、双链DNA 病毒，具有二十面体立体对称的衣壳结构，衣壳外为皮质层和囊膜[12]。目前，CyHV-2的全基因组测序与注释研究已经完成，病毒基因组全长为290 304 bp，共编码约154个潜在开放阅读框[13]。

在CyHV-2基因组中，开放阅读框4(open reading frame 4，ORF4)位于CyHV-2的反义链上，位置在ORF150～ORF151,其编码一种具有TNFR结构域的非结构蛋白。有研究报道，此类蛋白可能在CyHV-2 的免疫逃避中发挥作用[14]，但其具体功能尚未见报道。本研究中，利用杆状病毒表达系统表达纯化CyHV-2 ORF4重组蛋白，并通过小鼠免疫试验分析其免疫原性，以期为进一步研究 CyHV-2 ORF4蛋白的功能提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

BALB/c小鼠(生产许可证号:(辽)2013-0003)购自大连医科大学SPF动物实验中心。

pFastBac HTA质粒、大肠杆菌DH10 Bac感受态细胞、Sf9细胞(草地贪夜蛾细胞)、CyHV-2病毒由盐城工学院水生动物免疫与疾病研究所保存。ExTaq酶、T4 DNA 连接酶、限制性内切酶等购自宝生物工程(大连)有限公司；大肠杆菌DH5α感受态细胞购自生工生物工程(上海)股份有限公司；胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；鼠抗6×His tag单抗购自武汉博士德生物工程有限公司；AP标记的羊抗鼠IgG、FITC标记的羊抗鼠IgG购自碧云天生物技术公司；镍离子琼脂糖凝胶6FF预装柱购自赛尔瑞成(北京)生命科学技术有限公司；CellfectinTMⅡ转染试剂购自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 CyHV-2ORF4基因的扩增 参考GenBank数据库中CyHV-2ORF4基因序列(Gene ID: 14011391)，设计引物扩增CyHV-2ORF4的编码序列。其上游引物ORF4-F：5′GGAATTCGCCACCATGACACCTCCACCAACAACAC 3′；下游引物ORF4-R：5′CGGGTCGACAAGCTCTTCTGATGGA- GTGGGTGC 3′(下划线处分别为酶切位点EcoRⅠ和SalⅠ)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以CyHV-2感染异育银鲫的脾脏DNA为模板，用PCR法扩增CyHV-2ORF4基因片段。PCR反应条件为： 95 ℃下预变性5 min；95 ℃下循环变性1 min，60 ℃下退火复性1 min，72 ℃下延伸1 min，共进行32个循环；最后在72 ℃下再延伸10 min。将扩增产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳进行分析。

1.2.2 重组穿梭载体的构建 将ORF4扩增产物克隆至pMD19-T载体上，挑取阳性克隆菌株送至生工生物工程(上海)股份有限公司使用通用引物(RV-M：5′GAGCGGATAACAATTTCACACAGG 3′；M13-47：5′CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 3′)进行测序。选取测序正确的阳性菌株，大量培养后进行质粒小提，用限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ分别将pMD19-T-ORF4和pFastBac HTA载体进行双酶切，用T4 DNA Ligase进行连接后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，采用菌液PCR和测序鉴定后，获得重组穿梭载体pFastBac HTA-ORF4。将重组转移质粒转化至大肠杆菌DH10 Bac感受态细胞，涂布于含有四环素(10 mg/L)、硫酸卡那霉素(50 mg/L)、庆大霉素(7 mg/L)、IPTG/X-gal的蓝白斑筛选平板上，37 ℃下倒置培养48 h。挑取白色菌落加入SOC培养基中，振荡培养约3 h，按照通用引物(M13-F：5′CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG 3′；M13-R：5′AGCGGATAACAATTTCACACAGG 3′)进行菌液PCR鉴定，将阳性菌株进行重组杆粒DNA的提取，并命名为Bacmid-ORF4，4 ℃下保存备用。

1.2.3 重组杆状病毒的获得与鉴定 按照1×106个/孔的细胞数，将生长旺盛的Sf9细胞加入6孔细胞培养板中进行培养。将上述阳性重组杆粒Bacmid-ORF4，采用CellfectinTMⅡ转染试剂转染对数生长期的Sf9细胞，28 ℃下恒温培养，观察细胞病变，3～5 d 后细胞出现病变，收集细胞培养上清液，为第一代重组杆状病毒；用得到的P1代病毒继续感染Sf9细胞，28 ℃下恒温培养，获得P2代病毒；用P2代病毒继续感染Sf9细胞，28 ℃下恒温培养，获得P3代病毒。

将P3代重组杆状病毒接种Sf9细胞72 h后(同时设置空白细胞对照)，采用间接免疫荧光法(IFA)对重组杆状病毒进行鉴定。具体方法为：待转染的Sf9细胞出现病变后，吸弃上清液并加入适量体积分数4%的多聚甲醛。用含3% (质量分数)牛血清蛋白(BSA)的PBS于37 ℃下封闭1 h，加入鼠抗6×His tag单抗(1∶500稀释)为一抗，37 ℃下孵育1 h，用PBS洗涤；以FITC标记的羊抗鼠IgG抗体(1∶800稀释)为二抗，37 ℃下孵育1 h，用PBS洗涤。用含抗荧光衰减淬灭剂的封片剂进行封片，在倒置荧光显微镜(江南XD-202)下观察分析。

1.2.4 重组CyHV-2 ORF4蛋白的纯化 取P3代重组杆状病毒感染72 h后的Sf9细胞，用预冷PBS 洗涤，加裂解缓冲液(50 mmol/L Tris、500 mmol/L NaCl、5%甘油、10 mmol/L咪唑，pH 7.5)重悬，用超声波破碎细胞(超声10 s，停10 s，共进行10个循环)，4 ℃下以12 000 r/min 离心30 min，取细胞裂解上清液进行SDS-PAGE电泳，设置未转染杆状病毒感染Sf9细胞为阴性对照。收集病毒感染的Sf9细胞裂解上清液，使用琼脂糖凝胶6FF预装柱，依照说明书进行蛋白纯化。采用BCA 法测定蛋白浓度，-80 ℃下保存备用。

1.2.5 Western blot分析 将纯化产物转移到PVDF膜上，用含3%BSA的PBS于4 ℃下封闭过夜，用鼠抗6×His tag单抗(1∶2 000稀释)作为一抗，37 ℃下孵育1 h，用PBST洗涤3次，每次5 min；使用AP标记的羊抗鼠IgG(1∶3 000稀释)作为二抗，37 ℃下孵育1 h，用PBST洗涤3次，每次5 min。最后使用BCIP/NBT显色试剂盒于暗处显色20 min，观察有无棕色条带出现。

1.2.6 重组CyHV-2 ORF4蛋白的免疫原性分析将6只BALB/c小鼠分为两组，每组3只。对照组和试验组均在第0、7、14、21和28天时通过尾尖采血制备血清，于-80 ℃下保存备用。在对小鼠取血清结束后，试验组随即对每只小鼠注射重组ORF4蛋白进行免疫，对照组随即对每只小鼠注射PBS缓冲液。免疫过程具体为：将纯化的重组CyHV-2 ORF4蛋白溶液与弗氏佐剂混合(体积比为1∶1)后乳化，分别在第0、7、14、21天时以腹腔注射的方式免疫3只BALB/c小鼠，每只注射100 μg的ORF4蛋白(体积100 μL)，对照组每只小鼠注射100 μL PBS缓冲液。

以每孔1 μg重组ORF4蛋白包被酶标板，使用间接ELISA方法检测免疫小鼠诱导产生特异性抗体的效价。以制备的免疫血清作为一抗(100 μL/孔，1∶100稀释于PBS缓冲液中)，以AP标记的羊抗鼠IgG(1∶3 000稀释于PBS缓冲液中)作为二抗，加入pNpp-Na发色液后，用酶标仪测定405 nm波长下的吸光值。

2 结果与分析

2.1 CyHV-2 ORF4基因的扩增

采用PCR法对CyHV-2ORF4基因进行扩增，琼脂糖凝胶电泳显示，扩增产物在约1 000 bp处出现了一条特异性条带(图1A)，进一步将其克隆入pMD19-T载体上，经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切后，得到了大小约1 000 bp左右的条带(图1B)，这与ORF4基因的片段(Gene ID：140111391)大小相符。测序结果也表明，扩增片段与CyHV-2ORF4基因序列的一致性为100%。

M1—DL2000 DNA Marker；M2—DL5000 DNA Marker；1—PCR扩增产物；2—重组克隆质粒pMD19-T-ORF4的双酶切鉴定。

2.2 重组穿梭载体的构建与鉴定

分别用M13F、M13R引物对重组杆粒Bacmid-ORF4进行PCR 鉴定。从图2可见，PCR 产物用琼脂糖凝胶电泳后，在约3 500 bp处可见特异性条带, 与预期片段大小相符，表明OFR4基因转座成功。

M—DL10000 DNA Marker；1—重组杆粒DNA。

2.3 重组杆状病毒的获得

将重组杆粒Bacmid-ORF4转染到处于对数生长期的Sf9细胞中。从图3可见，转染72 h后细胞逐渐出现形态变圆、细胞核增大、边缘变亮、部分细胞破裂等变化，而未转染细胞状态良好，表明重组杆粒已成功转染Sf9细胞并生产出重组杆状病毒。

A—正常Sf9细胞；B—转染72 h后的Sf9细胞。

2.4 重组杆状病毒的IFA鉴定

将P3代重组杆状病毒接种到Sf9细胞72 h后，对重组杆状病毒进行IFA鉴定。从图4可见，感染重组杆状病毒的Sf9细胞出现特异性绿色荧光，而空白对照组未出现荧光，这表明外源ORF4蛋白在杆状病毒中成功表达。

A—正常Sf9细胞；B—转染72 h后的Sf9细胞。

2.5 重组ORF4蛋白的Western blot鉴定

将P3代重组杆状病毒接种到Sf9细胞72 h后，收集感染细胞裂解上清液进行SDS-PAGE电泳，并设置未感染细胞裂解上清液为对照。电泳图谱显示：在相对分子质量约40 000 处出现了一条特异的染色条带，表明重组杆状病毒感染后的Sf9细胞成功表达ORF4蛋白；进一步将细胞上清液进行亲和层析纯化，Western blot结果显示，纯化产物能与抗His单抗发生特异性反应(图5)。

M—蛋白Marker IV；1—空白细胞对照；2—病毒感染Sf9细胞的裂解上清液；3—纯化的ORF4蛋白；4—Western blot。

2.6 重组ORF4蛋白免疫原性分析

采用间接ELISA测定重组ORF4蛋白免疫小鼠第0、7、14、21、28天时血清中的特异性抗体效价。从图6可见，与对照组相比，重组ORF4蛋白免疫小鼠诱导产生了特异性抗体，且免疫组小鼠血清的效价随时间的延长而升高，在免疫后第28天时，OD405 nm值达到1.5左右，而对照组的OD405 nm在0.1以下。

图6 ORF4蛋白的免疫原性分析

3 讨论

3.1 CyHV-2 ORF4蛋白在杆状病毒表达系统中的表达

在与宿主长期共存的过程中，病毒进化出多种逃逸宿主免疫反应的机制，从而逃避宿主对自身的识别和清除。迄今，已发现多种病毒免疫逃逸方式，包括干扰抗原呈递途径[15-16]、干扰抗病毒细胞因子的调节[17]、干扰受感染细胞的凋亡[18]及干扰免疫相关细胞的功能[19]等诸多方面。正是由于这些免疫逃避机制的存在，最终导致宿主无法控制病毒增殖而死亡。在CyHV-2病毒中，ORF4蛋白具有TNFR结构域，其有介导病毒免疫逃逸的潜在作用。通过对CyHV-2 ORF4蛋白进行深入研究，可为CyHV-2的致病机制和防控策略开发等方面提供理论依据。

杆状病毒表达系统是一种新型的真核表达系统，其表达产物的生物学活性、结构与功能特点、抗原性和免疫原性等与天然外源基因产物极其相似，且杆状病毒具有高度的种属特异性，对脊椎动物无感染性，其表达的产物具有较高的生物安全性[20]。本试验中将ORF4扩增产物连接入pFastBac HTA质粒(该质粒携带His标签，可方便后期蛋白的表达鉴定及纯化)，结果显示，重组杆粒Bacmid-ORF4转染Sf9细胞后，出现了细胞变圆、细胞核明显增大、部分细胞破裂等现象，这表明成功获得了重组杆状病毒(图3)；IFA结果表明，外源蛋白在重组杆状病毒感染的细胞中成功获得了表达(图4)；将感染细胞的裂解上清液进行SDS-PAGE电泳，结果显示，在相对分子质量约40 000处有较弱的特异性条带，这与ORF4蛋白的理论相对分子质量相符；进一步采用亲和层析法进行纯化，成功获得了较纯的目的蛋白，Western blot结果显示，该蛋白能与抗His单抗发生特异性反应，结合蛋白相对分子质量分析，表明已成功利用杆状病毒表达系统在细胞中表达CyHV-2 ORF4重组蛋白。虽然ORF4蛋白在细胞上清液中的表达量不高，但纯化后蛋白纯度和浓度可满足进一步试验的要求。

3.2 CyHV-2 ORF4蛋白免疫原性分析

为检测杆状病毒表达的重组ORF4蛋白的免疫原性，将其免疫小鼠后在不同的时间点采血分离血清，并使用纯化的重组ORF4蛋白包被酶标板进行ELISA检测，结果显示，免疫重组ORF4蛋白组小鼠血清效价随时间延长而不断升高，血清效价变化规律与李天增[21]、魏思琪[22]等的试验结果相符。这表明，重组ORF4蛋白能够诱导小鼠产生特异性抗体，且免疫后第28天的血清效价达到较高水平，重组ORF4蛋白具有良好的免疫原性。

4 结论

1)本试验中以杆状病毒表达系统为工具，构建了Bacmid-ORF4重组杆粒并成功获得P3代重组杆状病毒。在P3代病毒感染的Sf9细胞超声裂解取上清中成功获得了高纯度的重组CyHV-2 ORF4蛋白。

2)获得的重组CyHV-2 ORF4蛋白表现出了较好的免疫原性，适合以其作为工具进行CyHV-2 ORF4 蛋白的功能性研究。