谷梦雅，王鹏杰，陈雪津，郑玉成，郭永春，林馨颖，高婷，侯炳豪，叶乃兴

茶树乙醇脱氢酶基因家族的鉴定及其在白茶萎凋过程的表达分析

谷梦雅，王鹏杰，陈雪津，郑玉成，郭永春，林馨颖，高婷，侯炳豪，叶乃兴*

福建农林大学园艺学院/茶学福建省高校重点实验室，福建 福州 350002

乙醇脱氢酶（Alcohol dehydrogenase，ADH）作为植物香气物质合成的脂肪酸代谢等途径中关键酶之一，对茶叶芳香物质的形成有着重要作用。从茶树染色体级别的基因组数据库中鉴定到19个基因家族成员。系统进化树显示，茶树的基因家族成员分成6个亚家族；共线性分析发现，茶树和拟南芥、葡萄与猕猴桃的基因家族之间分别存在2、4、12对共线性关系；茶树基因家族含有1～13个外显子，编码其氨基酸的数目为236～669，分子量为26.15～73.83 kDa，且主要定位于细胞质和叶绿体，仅定位于细胞核。此外，对上游启动子区域分析发现了大量与光响应、植物生长发育、胁迫和激素响应密切相关的顺式作用元件。荧光定量检测发现，在萎凋4 h时表达量最高；和在萎凋32 h时表达量最高，分别是对照的4.11倍和3.54倍；在萎凋48 h时达到峰值，略高于萎凋32 h的表达量；在萎凋40 h时表达量达到最高值；在萎凋24 h时表达量最高。以上结果为探究萎凋过程中乙醇脱氢酶基因对白茶脂肪族类芳香物质形成的分子机理提供参考。

白茶；萎凋；香气；基因家族；表达分析

茶树[（L.）O.Kuntze]是一种重要的多年生经济作物，其嫩梢芽叶含有大量次生代谢产物，如茶多酚、生物碱和茶氨酸等，因其独特的风味和保健功效而受到人们的广泛关注[1]。白茶与其他茶类相比，加工工艺只有萎凋和干燥两个步骤，其中萎凋工序对白茶香气和滋味的形成具有至关重要的作用[2]。鲜叶萎凋过程中，在内源酶的催化下，发生轻微的发酵，产生白茶特有的香气和滋味[3]。根据其代谢来源，茶叶挥发性化合物可分为四大类：脂肪酸衍生物、苯丙素类/苯烯类、萜类和异戊二烯类[4]。课题组前期研究显示，、和在白茶萎凋过程中的表达量显著上调，等基因在萎凋4 h和24 h的表达量达到峰值，表明萜烯类合成相关基因在白茶香气形成中发挥重要作用[5]。王鹏杰等[6]克隆了茶树的1个单萜合成酶（TPS）基因，发现其在白茶萎凋中的表达量上调。目前，有关茶树中脂肪族类芳香物质合成途径的关键基因研究较少。

乙醇脱氢酶（ADH，alcohol: NAD+oxidoreductase，EC 1.1.1.1）是一种锌结合酶，作为二聚体，依靠NAD(P)辅因子相互转化乙醇和乙醛，是中链脱氢酶（Medium-length dehydrogenase/reductase，MDR）蛋白质超家族的成员之一[7]。MDR是一个庞大的超基因家族，主要包括ADH（Alcohol dehydrogenase）家族、CAD（Cinnamyl alcohol dehydrogenase）家族、FDH（Formaldehyde dehydrogenease）家族、SDH（Sorbitol dehydrogenase）家族和QORX（Quinone oxidoreductase）家族等[8]。迄今为止，植物中的基因大多数成员属于中链ADH蛋白超家族（包括ADH1，EC 1.1.1.1；FDH，Class Ⅲ ADH，EC 1.2.1.1）[9]，有两个保守的结构域：GroES结构的ADH_N结构域和锌结合位点（ADH_zinc_N）。醇脱氢酶首次在玉米中被分离鉴定[10]，之后在甜瓜[11]、梨[12]、葡萄[13]、甘蔗[14]等植物中也鉴定出醇脱氢酶，目前对基因的研究主要集中在果实成熟[15]、生长发育[16]、逆境胁迫[17]等方面。ADH作为脂肪酸代谢等途径中关键酶之一，是醇脱氢酶家族在植物香气物质合成中最重要的酶[18]。在茶树中，辛肇军等[19]从龙井43中克隆了基因，发现的表达受到茶尺蠖取食、机械损伤、茉莉酸和水杨酸的诱导；彭海娇[20]研究表明，蚜虫为害诱导了基因的表达，对茶尺蠖幼虫取食所诱导的抗虫性基因的转录具有一定的拮抗作用。本课题组前期从茶树中克隆了基因，并发现其在白茶萎凋12 h时表达量最高，表明可能与白茶加工萎凋过程中脂肪族类芳香物质的形成有关[21]。

Zhou等[22]通过研究制作乌龙茶的鲜叶采后萎凋过程中基因的变化，在CSA基因组中初步鉴定了有共同结构域ADH_N和ADH_zinc_N的49个ADH蛋白序列，但并未对基因家族进行深入研究和比较分析。本研究在染色体级别的茶树基因组中鉴定了基因家族，通过生物信息学分析及荧光定量PCR检测基因在白茶不同萎凋时间的表达情况，为白茶脂肪族类芳香物质的形成以及白茶加工技术创新的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料与处理

以福鼎大白茶（‘Fuding Dabaicha’）为供试材料，于2019年4月从福建农林大学南区教学茶园采集。白茶萎凋试验处理参照陈雪津等[5]的方法，室内自然萎凋的温度设置为22～25℃，相对湿度设置为70%～75%。分别收集0.100 g的鲜叶（萎凋处理0 h）和萎凋处理4、8、16、24、32、40、48 h的叶片，共8个样品，均设置3个生物学重复，锡箔纸包裹标记，液氮固样后保存于–80℃超低温冰箱备用。

1.2 CsADH基因家族的鉴定及序列分析

本课题组前期已组装了茶树品种黄棪的基因组，本研究在此基础上鉴定了黄棪中的所有基因家族成员，从Pfam数据库下载（http://pfam.xfam.org/search#tabview=tab1）MDR超基因家族蛋白特征结构域ADH_N（PF08240.12）和ADH_zinc_N（PF00107.26）的隐马尔可夫模型，使用HMMER（https://plants.ensembl.org/hmmer/index.html）软件进行鉴定。利用Blast-P（E value≤1×10-5）在全基因组范围内进行比对搜索，去除冗余序列。去除任何不含ADH_N（PF08240.12）或ADH_zinc_N（PF00107.26）结构域的序列。使用CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）和SMARAT（http://smart.embl-heidelberg.de）进一步鉴定基因是否具有完整的ADH_N和ADH_zinc_N保守结构域。利用NCBI中的Protein BLAST和黄棪基因组注释文件进一步确定基因。利用在线网站ExPASy（https://web.expasy.org/protparam）分析茶树ADH蛋白的氨基酸组成、等电点和疏水性等理化性质，利用在线网站WoLF PSORT（https://wolfpsort.hgc.jp）进行亚细胞定位预测。

1.3 染色体定位和共线性分析

利用MG2C网站（http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0）绘制茶树基因家族的染色体分布图。从Ensembl Plants网站（http://plants.ensembl.org/index.html）获得拟南芥、葡萄和猕猴桃的基因序列和染色体文件，使用TBtools软件分析茶树与拟南芥、葡萄和猕猴桃基因家族的共线性。

1.4 进化树构建和基因结构分析

从TAIR数据库（https://www.arabidopsis.org/index.jsp）获取拟南芥AtADH的蛋白序列，从在线网站Phytozome（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）获得葡萄ADH蛋白序列；采用MEGA 7.0软件的邻接法（Neighbor-joining，NJ）构建系统进化树，Boostrap值设置为1 000；利用GSDS 2.0在线网站（http://gsds.gao-lab.org/index.php）分析CsADHs的结构信息，并将CsADHs的蛋白质序列提交至MEME工具（http://meme-suite.org/tools/meme）预测保守基序，基序的最大数目设置为10。

1.5 启动子顺式作用元件预测分析

在TBtools软件上提取CsADHs转录起始位点上游2 000 bp的基因序列，利用Plant CARE在线网站（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html）进行顺式作用元件预测分析。

1.6 组织特异性表达分析

从中国核酸数据库（GSA，https://bigd.big.ac.cn/gsa/index.jsp）下载茶树黄棪不同组织的转录组数据（登录号CRA003208），包括芽、嫩叶、成熟叶、茎和根。将原始数据映射到茶树基因组并计算每千碱基百万片段（FPKM）值，然后在TBtools工具包上可视化的表达水平。

1.7 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）

2 结果与分析

2.1 茶树ADH基因家族的鉴定和理化性质分析

结合使用BlastP比对和HMMER搜索等方法，从黄棪基因组数据库中共获得63条同时具有ADH_N和ADH_zinc_N结构域的蛋白序列。利用MEGA 7.0软件将茶树MDR超基因家族分别聚类到ADH（Alcohol dehydrogenase）、SDH（Sorbitol dehydrogenase）、CAD（Cinnamyl alcohol dehydrogenase）、QORX（Quinone oxidoreductase）家族（图1）。

表1 引物序列

进一步分析，推测19条序列为茶树基因家族成员，包括11个基因、3个基因和5个基因（表2）。的编码序列为711～2 010 bp，编码氨基酸数目为236～669。除了CsADH2、CsADH6、CsADH8、CsADH9、CsADH11和CsADH-like5，其他CsADH的等电点均小于7，为酸性蛋白，CsADH家族的分子量为26.15～73.83 kDa。大部分CsADH家族成员（74%）属于亲水性蛋白，仅CsADH9、CsFDH2、CsADH-like2、CsADH-like3和CsADH-like4属于疏水性蛋白。亚细胞定位分析表明，大部分家族成员主要定位于细胞质中，少数定位于叶绿体中，仅定位于细胞核。

图1 茶树MDR超基因家族聚类分析及ADH基因家族鉴定

表2 茶树ADH基因家族的理化性质

2.2 ADH基因家族的系统发育分析

为了研究茶树基因家族的进化关系，构建茶树、葡萄和拟南芥的系统进化树（图2）。结果表明，基因家族成员在这3个物种中明显地聚集成两组（Group A和Group B），除了、和主要聚类在Group A中，其他基因则聚类在Group B中。进一步可将基因家族分为6个亚组，Group A-1包含和，Group A-2包含—，Group A-3包含—，Group A-4仅有，Group B-1包含—、—，Group B-2包含、和。值得注意的是，Group A-4组和Group B-1组中仅有茶树分布，—和聚在Group A-3组中，其他3个亚组中茶树、葡萄和拟南芥都有分布。

2.3 茶树ADH基因家族的染色体分布和共线性分析

对19个基因进行染色体定位，结果显示，18个基因分布在5条染色体上（图3），1个基因（）分布在tig00101946上。进一步分析发现，基因在5条茶树染色体上的分布不均匀，10号染色体上分布较多，4号染色体和14号染色体均包含2个家族成员，6号染色体上包含3个基因，2号染色体只含有1个家族成员。为更好地了解茶树基因家族的起源和进化关系，本研究构建了茶树与拟南芥、葡萄和猕猴桃的共线性图谱（图4）。结果显示，茶树仅有2个ADH同源蛋白基因出现在拟南芥染色体中，而茶树与葡萄有4对共线性基因，与猕猴桃有12对共线性基因，推测茶树与猕猴桃之间的共线性关系比拟南芥与葡萄更显著。

图2 茶树、葡萄和拟南芥的ADH基因家族的系统发育分类

图3 茶树ADH基因家族的染色体定位

图4 茶树与拟南芥、葡萄和猕猴桃种间共线性分析

2.4 茶树ADH基因家族的基因结构和保守基序分析

为了评估基因家族的结构多样性，使用预测的全长CsADHs蛋白序列构建了系统进化树（图5-A）。19个基因家族成员的外显子-内含子结构是基于它们相应的编码和基因组序列产生（图5-B），基因组编码序列最长的是。基因的外显子数目从1（）到13（、）不等，内含子数目为0～12。大部分基因家族有10个外显子和9个内含子，而有11个外显子和9个内含子。此外，—、、、和的内含子都低于9个，没有内含子，表明家族成员结构差异较大。

使用MEME网站对19个CsADH蛋白进行保守基序分析（图5-C和图5-D），CsADH2、CsADH3、CsADH4、CsADH5和CsADH7包含10个基序，而不同的CsADH家族成员之间存在一些特定的基序，如Group A组中的ADH蛋白都缺少基序8，Group B组中的ADH蛋白都包含基序10，Group A-1和Group A-2亚家族中ADH蛋白还缺少基序7。

2.5 茶树ADH基因家族的启动子顺式元件分析

顺式元件的分布反映了基因的潜在功能和调控作用，通过分析上游2 000 bp的启动子序列发现，除了核心顺式元件（如CAAT-box和TATA-box等），共鉴定出39种顺式元件，包括23种光响应元件、4种植物生长调节元件、4种胁迫响应元件和8种植物激素响应元件（图6）。光响应元件占比较大，尤其是BOX 4元件，共58个，分布在18个基因家族成员。CAT-box、O2-site、GCN4-motif和circadian为植物生长元件。此外，的启动子区存在少量胁迫响应元件和植物激素应答顺式元件，包括参与干旱诱导的MYB结合位点（MBS）、厌氧诱导的必需基因（ARE）、低温响应元件（LTR)、防御和应激响应元件（TC-rich repeats）、脱落酸响应元件（ABRE）、茉莉酸酯响应元件（CGTCA-motif）、水杨酸响应元件（TCA-element）、生长素响应元件（TGA-element）、赤霉素响应元件（GARE-motif和P-box）等。

图5 茶树ADH家族的基因结构和保守基序分析

注：A：顺式元件的热图。颜色条和圆圈大小表示顺式元件的数量。B：每个类别中顺式元件的总和用不同颜色的条形图表示

Note: A: Heatmap of the number of-elements.Color bars and circle sizes indicate the number of-elements.B: The sum of the-elements in each category is represented by bars of different colors

图6 茶树基因家族启动子区顺式元件分析

Fig.6 Analysis of-elements in the promoter regions ofgene family in tea plants

2.6 茶树ADH基因家族在不同组织中的表达

为了进一步研究每个基因家族成员的潜在功能，本研究分析了在茶树芽、嫩叶、成熟叶、茎和根中的表达模式。由图7可知，在这5个组织中均高度表达，、和在这5个组织中的表达量也相对较高。部分基因的表达水平表现出显著的组织特异性，在嫩叶和成熟叶中的表达水平明显低于芽、根和茎，在成熟叶中的表达水平最高，则主要在芽和嫩叶中表达，和分别在嫩叶和茎中表达，表明这些基因在茶树的特定发育时期具有重要的作用。、、、和在组织中表达水平很低，而、和在各组织中均无表达。

2.7 茶树ADH基因家族在白茶萎凋中的表达量

利用qRT-PCR技术，以处理0 h样品为对照，分析茶树家族基因在白茶萎凋不同时间点的变化情况（图8）。结果表明，随着白茶萎凋时间的延长，、、—、、、、、的表达量呈下降趋势；在萎凋4 h时表达量为对照的10.36倍，在4～8 h显著下降，16～24 h显著上升；和在萎凋32 h时表达量最高，分别是对照的4.11倍和3.54倍；在萎凋48 h时表达量达到峰值，略高于萎凋32 h的表达量；在萎凋40 h时表达量达到最高值；在萎凋24 h时表达量最高。

3 讨论

3.1 茶树ADH基因家族成员的序列特征

在植物中，是一个小的基因家族，起源于谷胱甘肽依赖型甲醛脱氢酶（Glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase，GSH-FDH）基因，也被称为Class Ⅲ ADH[7]。基因在不同物种中数量各异，如甜瓜中有13个[11]，葡萄和甘蔗中分别有10个和32个[14]，本研究首次在茶树染色体级别数据库中鉴定到19条候选基因。植物中基因内含子的标准数量是9个[24]，在茶树中，基因家族的内含子数量为1～13个，其中—、、、—包含标准的9个内含子和10个外显子，类似于玉米和草莓等植物中的基因[25]。结构差异普遍存在，可能在重复基因的进化过程中发挥重要作用，外显子和内含子的增加或减少对结构差异和功能分化的贡献是显著的[26]，本研究中、、—、和内含子和外显子的差异意味着基因可能存在功能差异和分化，这需要进一步研究验证。

注：A表示成熟叶，B表示根，C表示嫩叶，D表示芽，E表示茎

Note: A is mature leaf.B is root.C is young leaf.D is bud.E is stem

图7 茶树基因家族在不同组织中的表达谱

Fig.7 Expression patterns ofgene family in different tissues

注：不同小写字母表示在＜0.05水平差异显著

Note: Different lowercase letters indicate significant difference (＜0.05)

图8 茶树基因在白茶萎凋中的表达量

Fig.8 Expression of teagenes in white tea withering

3.2 ADH基因在茶树组织中特异性表达

基因参与植物生长和发育的不同方面，在植物组织中以发育调节的方式表达。Tesniere等[13]研究发现，葡萄中的和转录本在幼果中短暂积累，而转录本在成熟阶段显著增加。在矮牵牛中，在未成熟的花粉中表达量较高，在花柱中表达量较高，在子房和低氧根中表达量较高[16]；在甜瓜中，和在果实中特异表达，而在营养组织中没有表达或表达非常低[27]；在芒果中，在叶和花中不表达，但在茎中表达，在叶中表达，在果实发育和膨大的整个过程中表达量都很高[15]；这些研究表明，基因在植物中存在明显的组织特异性表达。本研究发现，在根的表达水平最高，表明该基因可能对茶树根的发育起到重要作用；在成熟叶中的表达水平最高，主要在芽和嫩叶中积累，和分别在嫩叶和茎中表达，表明这些基因可能在茶树的特定发育时期发挥重要的作用；此外，、、和在根、茎、成熟叶、嫩叶和芽中均有较高表达，推测这4种基因参与茶树的组织发育过程。

3.3 CsADH可能参与调控白茶萎凋过程的香气形成

ADH作用于植物香气的形成，在矮牵牛中，和基因在花香味形成过程中起着特殊的作用[16]。在甜瓜中，和基因共同影响芳香化合物的产生[27]；在梨中，、和的表达水平与果实发育过程中芳香化合物的含量密切相关，并且在果实成熟过程中起着催化醛转化为醇的作用[12]。Speirs等[28]发现，成熟番茄果实中ADH水平的增加伴随着C6醇水平的增加和更多的“成熟果实”风味，表明ADH可能在蜜腺和花瓣中产生香味。不饱和脂肪酸在ADH的作用下，催化顺3-己烯醛生成青叶醇，散发清香[21]。在红茶加工过程中，鲜叶经萎凋处理后会使对香气品质有利的芳樟醇等挥发性香气化合物的含量提高，而使具有青草味的-2-己烯醛含量降低[29]。萎凋是形成白茶品质的关键工序，长时间的萎凋引起白茶鲜叶内部发生复杂的理化变化，如亚油酸、亚麻酸等不饱和脂肪酸在酶的作用下降解为小分子的醇、醛、酮和酸类香气化合物[30]，前人研究表明，在萎凋20 h或24 h时，醇类化合物的含量在白茶的香气变化过程中逐渐增加[31-32]；高晨等[21]研究发现，在白茶萎凋12 h时表达量最高，推测可能在白茶萎凋过程的不饱和脂肪族醇类香气化合物合成中起重要作用。本研究发现，在萎凋4 h时表达量最高，和在萎凋32 h时表达量最高，分别是对照的4.11倍和3.54倍；在萎凋48 h时达到峰值，在萎凋40 h时表达量达到最高值，在萎凋24 h时表达量最高，推测、、、、和在白茶香气形成过程中起到将醛转化为醇的作用，为其提供丰富的前体衍生物，以此作用于茶叶萎凋过程中脂肪族类香气物质的合成，形成白茶清香的特点。

本研究在茶树染色体级别的基因组中鉴定出19个基因家族成员，对其进行系统发育进化、共线性、基因结构和组织特异性表达分析等，并采用荧光定量PCR分析这些基因在白茶萎凋过程中的表达情况，推测基因在白茶萎凋过程的脂肪族类芳香物质合成中起着重要作用。

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Identification of Alcohol Dehydrogenase Gene Family and Their Expression Analysis in the Withering Process of White Tea

GU Mengya, WANG Pengjie, CHEN Xuejin, ZHENG Yucheng, GUO Yongchun, LIN Xinying, GAO Ting, HOU Binghao, YE Naixing*

College of Horticulture, Fujian Agriculture and Forestry University/Key Laboratory of Tea Science in Universities of Fujian Province, Fuzhou 350002, China

Alcohol dehydrogenase (ADH) plays an important role in the formation of tea aroma as one of the key enzymes in the synthesis of fatty acid metabolism pathway.In this study, 19gene family members were identified from the chromosome level genome database of tea plants for the first time.Bioinformatics analysis shows that the members ofgene family were divided into six subfamilies.Collinearity analysis shows that there were 2, 4 and 12 pairs ofcollinearity betweengene family ofand,and, respectively.The teagenefamily contains 1-13 exons, which encode 236-669amino acids with molecular weight of 26.15-73.83 kDa.It is mainly located in cytoplasm and chloroplast, and onlyis located in nucleus.In addition, a large number of-acting elements closely related to light responsive, plant growth, stressand phytohormone responsive were found in the upstream promoter region.Fluorescencequantitative detection shows that the expression ofwas the highest at 4 h of withering.The expressions ofandwere the highestat 32 h of withering,which were 4.11 and 3.54 times that of the controlrespectively.The expression ofreached the peak at 48 h of withering, which was slightly higher than that at 32 h of withering.The expression ofreached the highest value at 40 h of withering.The highest expression ofwas at 24 h of withering.This study provided a reference for exploring the molecular mechanism of alcohol dehydrogenase genes acting on the formation of aliphatic aromatic substances in the withering process ofwhite tea.

white tea, withering, aroma,gene family, expression analysis

S571；Q52

A

1000-369X(2021)03-302-13

2020-12-21

2021-02-22

财政部和农业农村部：国家现代农业产业技术体系（CARS-19）、福建农林大学科技创新专项基金（CXZX2017181）、福建农林大学优秀硕士学位论文资助基金（1122YS01001）

谷梦雅，女，硕士研究生，主要从事茶树栽培育种和生物技术方面的研究。*通信作者：ynxtea@126.com

（责任编辑：黄晨）