岳文杰，金心怡，陈明杰，叶乃兴，郭丽，赵峰

基于非靶向代谢组学分析白茶室内自然萎凋过程代谢物的变化规律

岳文杰1,2,3，金心怡2*，陈明杰4*，叶乃兴2，郭丽5，赵峰6

1.福建农林大学金山学院，福建 福州 350002；2.福建农林大学园艺学院，福建福州 350002；3.福建农林大学园艺植物生物学及代谢组学研究中心，福建 福州 350002；4.信阳师范学院生命科学学院及河南省茶树生物学重点实验室，河南 信阳 464000；5.中国农业科学院茶叶研究所，浙江 杭州 310008；6.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122

以福安大白茶品种鲜叶为材料，按照室内自然萎凋工艺加工白茶，每隔3 h采集过程样，利用非靶向代谢组学技术分析了代谢物的含量变化。结果表明，在白茶室内自然萎凋过程中，茶鲜叶中的代谢物含量呈现规律性的动态变化。研究共鉴定到106种代谢物，其含量呈现5种主要变化趋势。这些变化趋势可以分为4个阶段，分别为萎凋前24 h、萎凋24～48 h、萎凋48～57 h、萎凋57 h之后。这些差异代谢物按照结构分为4种类型：类黄酮化合物中8种单体儿茶素（Catechins）在萎凋过程中呈现下降趋势；18种原花青素物质（PAs）和5种聚酯型儿茶素（TSs）有升有降；含没食子酰基的PAs与TSs含量均呈现上升趋势，而未含该基团的两类物质含量则呈现下降趋势。糖苷衍生物中6种山奈酚（Kaempferol）糖苷，4种槲皮素（Quercetin）糖苷，1种芹菜素（Apigenin）糖苷含量均呈上升趋势，且在萎凋48 h后含量明显上升。在萎凋过程中12种酚酸类物质中5种呈现上升趋势，7种呈现下降趋势，这些物质均在萎凋至57～60 h时出现最高或最低值。此外，分析了生物碱、氨基酸与多肽、香豆素类、糖等20种代谢物的含量变化，其中咖啡碱含量呈现上升趋势，在萎凋60 h时最高，可可碱含量在萎凋中期下降明显，萎凋后期略有回升，2种茶氨酸异构体和4种香豆素物质含量在萎凋至12 h达到峰值，此后总体呈下降趋势。本研究为明确白茶在自然萎凋加工过程中的生物代谢调控机制提供重要参考。

白茶；自然萎凋；非靶向代谢组学；代谢物

白茶为我国传统六大茶类之一，主产于福建福鼎、政和、建阳、松溪等地，是福建省特有茶类。与绿茶、红茶、乌龙茶等茶类的加工工艺不同，白茶在加工过程中不炒不揉，特别是茶叶鲜叶经历了长时间的萎凋，期间缓慢的发酵（氧化）赋予了白茶独特的香气与滋味[1-3]，并形成了抗自由基活性、保护神经、提高体外抗癌活性、抑制沙门氏菌等多种保健功效[4-14]。室内自然萎凋是常见的白茶萎凋方式之一，相较于加温萎凋与复式萎凋，其萎凋时间更长，使茶鲜叶表面水分散失和叶细胞浓度改变更为缓慢，从而减缓了鲜叶主要生化成分的变化，有利于白茶特有香气和滋味的形成。已有研究表明，在白茶萎凋过程中，茶多酚总量、EC、EGC和EGCG等儿茶素组分含量呈现“先升高后降低”的趋势[15-16]，与儿茶素合成相关的关键基因也出现下调[17-18]，3-甲基-ECG、3-甲基-EGCG含量则在萎凋前期较鲜叶大幅提升，茶黄素、茶黄素3-没食子酸酯、聚酯型儿茶素A、聚酯型儿茶素B等含量也有提升[19]，咖啡酸、没食子酸、柠檬酸等酚酸物质呈递增趋势，而香豆酸、绿原酸、奎宁酸、茶没食子素、没食子酰葡萄糖苷1、没食子酰葡萄糖苷2等呈递减趋势[20]；生物碱中的咖啡碱含量升高，可可碱含量下降，而由于核糖核酸的降解，()-5'-脱氧-5'-(甲基亚磺酰基)腺苷、5'-甲硫腺苷、腺苷、腺嘌呤核苷酸和鸟苷等多种核苷（酸）含量也显著上升；此外，蛋白组学研究发现，在白茶萎凋过程中会出现多种蛋白质降解、大部分游离氨基酸含量提升、茶氨酸含量下降的现象[21-22]。而白茶风味也随之发生变化。当萎凋减重率＞20%时，风味物质开始产生；萎凋减重率达40%之后形成较快；萎凋减重率≥60%时，白茶风味在香气、滋味方面均表现明显[23]。

随着对白茶萎凋过程中不同代谢物含量变化研究的开展，特别是以高通量、高灵敏度为特点的新兴非靶向代谢组学技术在茶叶领域的应用，为解析白茶代谢物在萎凋过程中的变化提供了先进的研究手段。为了进一步了解白茶在自然萎凋过程中代谢物的变化规律，本研究以福安大白茶品种鲜叶为试验材料，按照室内自然萎凋工艺加工白茶，采用UPLC-QTOF MS结合多变量分析方法，通过获取代谢物的丰度信息，分析白茶在室内自然萎凋过程的代谢物变化，发掘在萎凋过程中的主要差异代谢物及其动态变化规律，以期为白茶加工技术提供理论依据，并为进一步明确白茶在自然萎凋加工过程中的生物合成与调控机制提供重要信息。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选用福安大白茶品种为试验材料，福建省南平市政和瑞茗茶叶有限公司提供，于2016年5月25日采摘一芽三四叶，室内自然萎凋工艺制备白茶茶样，萎凋室内环境温湿度分别为(26.6±1.4)℃、(88.9±3.4)%，萎凋60 h，用链板式烘干机于120℃烘20 min，得烘干样待用。

1.2 主要试剂与仪器

乙腈、甲醇、甲酸购自德国默克公司；乙酸购自美国天地公司；去离子水由Milli-Q净水系统制备；所有化学试剂均为色谱纯级。

标准品信息：原花青素B1（Procyanidin B1）、原花青素B2（Procyanidin B2）、原花青素B3（Procyanidin B3）、原花青素A1（Procyanidin A1）、原花青素A2（Procyanidin A2）等购自中国Chemface公司；没食子酸（Gallic acid）、绿原酸（Chlorogenic acid）、儿茶素（Catechin，C）、表儿茶素（Epicatechin，EC）、没食子儿茶素（Gallocatechin，GC）、表没食子儿茶素（Epigallocatechin，EGC）、儿茶素没食子酸酯（Catechin gallate，CG）、表儿茶素没食子酸酯（Epicatechin3--gallate，ECG）、表没食子儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）、槲皮素、山奈酚、咖啡酸（Caffeic acid）等购自美国Sigma公司；可可碱（Theobromine）购自中国西力公司。

5430R型台式高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；KQ-300GDV型恒温数控超声波萃取设备（中国昆山市超声仪器有限公司）；G560E Vortex-Genie涡旋振荡器（美国Scientific Industries公司）；SYNAPT G2-Si HDMS超高效液相色谱串联飞行时间质谱仪（美国Waters公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 样品采集方法及标记

在白茶室内自然萎凋过程中，每隔3 h取一次过程样，为确保样品真实反映代谢物含量变化，取样时选取10个完整的一芽三、四叶样品为一组，用锡箔纸包裹后置于液氮中保存，每个过程样取3个重复，取样完成后迅速冻干处理，保存于–80℃超低温冰箱。样品标记为：F（鲜叶），N1—N21（萎凋过程样与烘干样）。

1.3.2 茶样检测的前处理方法

将茶样研磨成粉后称取(10±0.5)mg，添加200 µL 80%甲醇（色谱级）后进行超声萃取（超声条件：25℃，30 min），后于常温下12 000离心3 min，取上清液至1.5 mL离心管中；重复添加甲醇、超声萃取、离心步骤2次，合并上清液；添加200 µL 80%甲醇（色谱级）、0.1%甲酸（/）继续超声萃取、离心，并重复该步骤1次，合并上清液；上清液通过0.2 µm孔径过滤器过滤，上机检测前对滤液稀释50倍后进样。

1.3.3 质量控制样（QC sample）的制备

将研磨成粉的全部样品，各称取105～110 mg充分混匀后，称取150 mg置于离心管中，按照上述茶样前处理步骤（保持浓度一致）进行提取制备后供上机检测，标记为QC。

1.3.4 空白对照样（Blank sample）的制备

按照茶样的前处理方法，在不加入样品只添加相应等量试剂的情况下，采取同样条件提取制备后供上机检测，标记为Blank。

1.3.5 超高效液相色谱串联飞行时间质谱参数设定

色谱柱：Acquity UPLC HSS T3 column（100 mm×2.1 mm，1.8 μm，英国Waters公司）。

流动相条件：A为5%（/）乙腈水溶液，B为含0.1%（/）甲酸的乙腈溶液。

线性梯度洗脱条件：起始0 min，0% B；2 min时7% B；13 min时B达到40%；14 min时，B达到100%；17 min时，B恢复到0%。

进样参数：分析时间20 min，连续进样间隔4 min；进样体积1 μL；流速为0.3 mL·min-1。其他参数设定：采取ESI(+/-)电离方式，毛细管电压±2.0 kV，离子源温度120℃，进样锥气体流速为50 L·h-1，脱气流速为800 L·h-1，电子轰击能量10～40 eV，m/z扫描范围为0～1 200 Da的全扫描分析。

1.4 数据采集与处理方法

1.4.1 数据采集方法

每个样品分别以正负两种离子模式（ESI+和ESI-）扫描获得两组数据，质量控制样（QC）在运行过程中每隔10个样品注射1次，以监测仪器的稳定性。设备通过MassLynx 4.1（美国Waters公司）软件进行操作。

采集完毕的原始数据导入Progenesis QI（v2.1，Nonlinear Dynamics, Newcastle upon Tyne, UK）软件开展峰对齐-峰采集-去卷积化等处理，获取包含质荷比（m/z）、保留时间及物质峰面积等信息的数据表格。数据表格利用空白对照样清除污染，质量控制样计算相对标准偏差（RSD），去除RSD超过30%的不可靠物质信息，并校正各茶样质量（精确至1 mg），计算获取各过程样3个重复的平均值后开展数据分析。

1.4.2 代谢产物的鉴定

代谢产物根据精确分子量、MS/MS二级碎片信息、购买的化合物标准品，通过在线搜索HMDB（http://www.hmdb.ca）、ChemSpider（http://www.chemspider.com）和Metlin（metlin.scripps.edu）等数据库以及相关参考文献进行物质鉴定。

1.4.3 数据处理

采用SIMCA-P+14.1软件进行主成分分析（PCA），采用MultiExperiment Viewer 4.9.0（MeV）软件进行热图分析（Heat-map）。采用SPSS 22.0统计软件进行单因素方差分析（ANOVA）。采用Excel 2016软件绘制相关图表。

2 结果与分析

2.1 代谢物主成分分析

对两种不同离子模式下（正、负离子）采集的数据进行处理，分别得到1 067种和883种代谢物。为了更加直观地揭示自然萎凋加工过程中白茶代谢物的变化，采用PCA探索不同萎凋时间样品间的相关性。结果表明，在负离子模式下，由22个茶样（鲜叶F、萎凋过程样与烘干样），883个代谢物组成的主成分分析模型中，第一和第二主成分分别解释了总方差的72.0%和12.6%，表明模型可靠。在PCA的得分图（Score plot）上，22个茶样随着萎凋时间的推移，呈现沿第一主成分负方向发展的基本规律，表明在室内自然萎凋加工过程中，茶叶鲜叶中的代谢物含量在发生缓慢的变化。其中在白茶萎凋的前24 h内，茶样在得分图上基本聚集在一起，表明相较于其他茶样，萎凋前24 h的8个茶样（含鲜叶）中的代谢物组成具有更高的相似性。此外，在第一主成分坐标系中，还形成了萎凋前24 h、24～48 h、48～57 h、57 h之后等4个相似性较一致的区域（图1-A）。正离子模式下的主成分分析得分图（第一和第二主成分分别解释了总方差的71.0%和11.9%）也呈现与负离子相似的规律，22个茶样随着萎凋时间的推移，呈现沿第一主成分正方向发展，但不同萎凋时间茶样在得分图上聚集的规律不明显，萎凋前39 h代谢物组成具有更高的相似性（图1-B）。

2.2 差异代谢物的筛选、鉴定与总体变化的热图分析（Heat-map）

利用SPSS软件，以正、负两种离子模式下的1 067个和883个代谢物的响应强度（峰面积）为指标，进行单因素方差分析，以获得每个代谢物的值，并以<0.05（Bonferroni校正）筛选白茶室内自然萎凋过程中的差异代谢物，进行物质鉴定，在正、负离子模式下共鉴定到差异代谢物106个，这些差异代谢物在萎凋过程中的变化规律如图2所示。

在室内自然萎凋过程中，106个主要差异代谢物含量的变化趋势主要分为5种类型：第一类呈现“低→高→低”的变化趋势，这类代谢物在萎凋前期的含量较低，而随着萎凋的进行，24 h后含量开始上升，至48 h的含量出现明显的下降趋势；第二类呈现“高→较低→低”的变化趋势，在萎凋前期的含量最高，而随着萎凋的进行，含量不断下降，特别是萎凋至24 h时，含量出现比较明显的下降趋势；第三类呈现“高→较高→低”的变化趋势，这类代谢物在萎凋前48 h均保持较高含量，而在萎凋后期，其含量出现明显的下降趋势；第四类呈现“低→较高→高”的变化趋势，这类代谢物在萎凋前期的含量低，而萎凋至24 h时含量明显上升，直至萎凋结束；第五类呈现“低→较低→高”的变化趋势，这类代谢物萎凋至48 h，含量才明显上升，直至萎凋结束。

2.3 不同类别差异代谢物含量变化分析

2.3.1 儿茶素及其聚合物在萎凋过程的含量变化

7种鉴定到的单体儿茶素：Catechin（C）、Epicatechin（EC）、Gallocatechin（GC）、Epigallocatechin（EGC）、Catechin gallate（CG）、Epicatechin3--gallate（ECG）、Epigallocatechin gallate（EGCG）在萎凋过程中含量均呈现下降的趋势，且均在萎凋至48 h后含量大幅降低。其中EGCG在萎凋中前期保持较高含量，萎凋至48 h时含量迅速下降直至萎凋结束；EGC在萎凋24 h时，开始出现大幅下降的趋势，在萎凋27 h之后回升，至48 h含量持续下降。与鲜叶相比，C、GC、EC、EGC的含量分别下降70.01%、84.63%（ESI-）、77.46%（ESI+）和91.08%，3种酯型儿茶素CG、ECG、EGCG的含量分别下降94.51%、23.60%和60.66%。甲基化儿茶素3-甲基-EGCG [Epigallocatechin 3-(methyl-gallate)]含量与其他单体儿茶素规律一致，呈现下降趋势，含量最高下降67.06%，4-甲基-ECG [Epicatechin 3--(4-methylgallate)]则在萎凋中期开始上升，至萎凋48 h时含量最高，相比鲜叶升高90.65%（图3）。

注：A：负离子模式； B：正离子模式；F：鲜叶；N：室内自然萎凋茶样（N1—N20依次为萎凋3 h、6 h……60 h过程样，N21为63 h为烘干样）

Note: A: negative ion mode, B: positive ion mode, F: fresh leaves, N: indoor withering white tea samples, N1: 3 h withering sample, N2: 6  h withering sample, ……, N20: 60 h withering sample.N21: 63 h drying sample

图1 室内自然萎凋白茶的主成分得分图

Fig.1 The principal component score plot analysis (PCA) of indoor withering white tea

注：*表示正离子模式下鉴定到的差异代谢物，下同

Note: * differential metabolites identified in positive ion mode.The same below

图2 白茶室内自然萎凋过程代谢物变化热图（Heat-map）

Fig.2 The heat-map of indoor withering white tea

在白茶的萎凋过程中，茶样中的原花青素类物质含量主要呈现两种变化趋势，11种物质在制茶过程中含量上升，其中3,3'-双没食子酰基原花青素B2（3,3'-Digalloylprocyanidin B2）、3,3'-双没食子酰基原飞燕草素B5（3,3'---galloylprodelphinidin B5）、表阿夫儿茶素-表儿茶素双没食子酸酯（Epiafzelechin-epicatechin 3,3'-digallate）、表儿茶素没食子酸酯-(4->6)-表没食子儿茶素没食子酸酯[Epicatechin 3--gallate-(4->6)-epigallocatechin 3--gallate，ECG-(4->6)-EGCG]、表儿茶素没食子酸酯-(4->8)-表没食子儿茶素没食子酸酯[Epicatechin 3--gallate-(4->8)-epigallocatechin3--gallate，ECG-(4->8)-EGCG]、表儿茶素-没食子儿茶素[Epicatechin-(4->8)-gallocatechin，EC-GC]、表没食子儿茶素-儿茶素[Epigallocatechin-(4->8)-catechin，EGC-C]、原飞燕草素A没食子酸酯（Prodelphinidin A-2 3'--gallate）、表儿茶素-表儿茶素-表儿茶素[Epicatechin-(4->6)-epicatechin-(2->7,4->8)-epicatechin，EC-EC-EC]等物质相较于鲜叶含量分别提升47.23%、54 565.06%、36.15%、595.47%、2 472.51%、80.40%、105.39%、3 631.26%和1 546.93%，而3'-没食子酰基原飞燕草素B2（3'-Galloylprodelphinidin B2）、原花青素A2（Procyanidin A2）等2种物质在鲜叶中未检出，萎凋则促进了他们含量的大幅度提升。从萎凋时间上看，原飞燕草素A没食子酸酯、原花青素A2等含量在萎凋前24 h上升速率明显提升，而ECG-(4->8)-EGCG、3,3'-双没食子酰基原飞燕草素B5、ECG-(4->6)-EGCG、3'-没食子酰基原飞燕草素B2等物质含量在萎凋至45 h时开始大幅提升。而原花青素B1、B2、B3、C1、两种原飞燕草素B异构体、原花青素三聚体等7种物质则呈现下降趋势，其中两种原花青素B异构体含量在萎凋至18 h时大幅下降，至萎凋48 h后逐渐下降至仪器检出线以下。研究发现，含没食子酰基的原花青素类物质含量均呈现上升趋势，而由表儿茶素与表没食子儿茶素聚合形成的原花青素类和原飞燕草素类物质则均呈下降趋势（图4）。

注：*表示正离子模式下鉴定到的差异代谢物

Note: * differential metabolites identified in positive ion mode

图3 白茶室内自然萎凋过程样的单体儿茶素类物质变化

Fig.3 The changes of catechins in indoor withering white tea

鉴定到的4种聚酯型儿茶素（TSs）中，聚酯型儿茶素A、B、F（Theasinensin A、B、F）等3种物质含量在萎凋过程中呈上升趋势，聚酯型儿茶素A含量在萎凋至60 h时较鲜叶提升8 983.37%，聚酯型儿茶素B和聚酯型儿茶素F则分别提升6 672.05%和242.05%，聚酯型儿茶素C含量则呈下降趋势，至萎凋57 h后下降到仪器检出线以下（图4）。研究发现，含量上升的聚酯型儿茶素A、B、F均含有没食子酰基，而含量下降的聚酯型儿茶素C不含该基团，这种规律与上述原花青素物质含量变化规律一致。

注：*表示正离子模式下鉴定到的差异代谢物

Note: * differential metabolites identified in positive ion mode

图4 白茶室内自然萎凋过程样的原花青素类与聚酯型儿茶素物质变化

Fig.4 The changes of PAs and TSs in indoor withering white tea

2.3.2 黄酮及其糖苷在萎凋过程的含量变化

在室内自然萎凋白茶加工过程样中共鉴定到21种黄酮及其糖苷物质。其中6种山奈酚糖苷：（山奈酚3--半乳糖苷Kaempferol 3----galactopyranoside，+65.54%）、山奈酚3--半乳糖基-鼠李糖苷（Kaempferol-3--galactosyl-rhamnosyl-glucoside，+88.57%）、山奈酚3--葡萄糖基-鼠李糖苷（Kaempferol-3--glucosyl-rhamnosyl-glucoside，+55.03%）、山奈酚3--新橙皮糖苷/山奈酚-4′′--牡荆素葡萄糖苷（Kaempferol-3--neohesperidoside/Kaempferol-4′′--glucosylvitexin，+415.20%）、山奈酚-3--芸香糖苷（Kaempferol-3--rutinoside，+62.58%）、山奈酚-3--吡喃葡萄糖苷（Kaempferol-3----glucopyranoside，+28.18%）；4种槲皮素糖苷：槲皮素2-没食子酰葡萄糖苷（Quercetin 3-(2-galloylglucoside)，+166.22%）、槲皮素3--半乳糖基-芸香糖苷（Quercetin 3--galactosyl-rutinoside，+96.51%）、槲皮素3--吡喃葡萄糖基-吡喃鼠李糖基-半乳糖苷（Quercetin-3--[--glucopyranosyl-(1→3)---rhamnopyranosyl-(1→6)---galactopyranoside]，+116.14%）、槲皮素3--葡萄糖基-鼠李糖基-香豆酰己糖苷[Quercetin-3--glucosyl-rhamnosyl-(-coumaroyl)hexoside），+17.83%]；1种芹菜素糖苷：芹菜素6--葡萄糖基8--阿拉伯糖苷（Apigenin 6--glucoside 8--arabinoside，+350.79%）。它们在萎凋过程中含量变化出现较为一致的规律，均在萎凋后期，特别是萎凋48 h后开始不断升高。这11种糖苷物质中，信号强度最高（峰面积）的3种物质是山奈酚3--葡萄糖基-鼠李糖苷、槲皮素3--吡喃葡萄糖基-吡喃鼠李糖基-半乳糖苷和山奈酚3--半乳糖基-鼠李糖苷（图5）。

注：*表示正离子模式下鉴定到的差异代谢物

Note: * differential metabolites identified in positive ion mode

图5 室内自然萎凋白茶过程样的黄酮及其糖苷物质变化

Fig.5 The changes of flavonoids and glycosides in indoor withering white tea

2.3.3 酚酸类物质在萎凋过程的含量变化

在白茶萎凋过程鉴定到的18种具有差异性的酚酸类物质中，2,4,6-三羟基苯甲酸甲酯（Methyl 2,4,6-trihydroxybenzoate）、没食子酸、5--反式香豆酰基奎宁酸异构体1（5--trans-Coumaroylquinic acid isomer1）、柠檬酸/异柠檬酸（Citric acid/Isocitric acid）、对香豆酸（-coumaric acid）、1-没食子酰基葡萄糖异构体4（1-Galloyl-glucose ISOMER4）等6种物质在加工过程中含量提升，萎凋至57～60 h时，其含量达到最大值，与鲜叶比较，这些物质的含量分别提升了150.80%、659.81%（ESI-）、54.57%、89.79%、45.59%和688.32%。而茶没食子素（Theogallin）、()-8-羟基-2-辛烯-4,6-二炔酸[()-8-Hydroxy-2-octene- 4,6-diynoic acid]、4-羟基苯丙酮酸（4-Hydroxyphenylpyruvic acid）、对羟基扁桃酸（-Hydroxymandelic acid）、奎宁酸（Quinic acid）、3-羟基苯甲酸（3-Hydroxybenzoic acid）、咖啡酸（Caffeic acid）、水杨酸（Salicylic acid）、绿原酸（Chlorogenic acid）、5-咖啡酰奎宁酸（5-Caffeoylquinic acid）等10种物质含量在萎凋过程中呈现下降趋势，其含量变化与上述6种物质相反，且在萎凋后期（57～60 h）含量下降至最低值，较鲜叶含量分别下降54.13%、78.13%、75.46%、74.86%、44.47%、25.95 %、94.26%、92.33%、51.26%和95.85%（图6）。

2.3.4 其他物质在萎凋过程的含量变化

此外，在白茶萎凋过程中还鉴定了20种其他代谢物，主要包括生物碱、氨基酸与多肽、香豆素类、糖类等。如图7所示，白茶萎凋过程中，咖啡碱（Caffeine）含量提升，但在萎凋前42 h变化不明显，萎凋60 h时含量达到最大值，相较鲜叶提升达65.78%，烘干使其含量下降14.96%。可可碱在萎凋初期含量较高，随着萎凋的进行，含量开始下降，且下降速率不断升高（与鲜叶比较），至萎凋27 h时，下降速率达到最大；此后含量略微回升，至萎凋48 h其含量上升明显，萎凋54 h出现小幅回落后继续上升直至萎凋结束。2种茶氨酸异构体（Theanine isomer）均在萎凋初期上升，至萎凋12 h达到峰值（较鲜叶分别提升89.87%和69.43%）；直至萎凋54 h出现第二个次峰值前，总体呈现下降趋势；接着继续下降直至萎凋结束。7-Ethoxy-4-methyl-2-1-benzopyran-2-one、Aegelinol、Aesculetin、Umbelliferone等4种香豆素类物质也在萎凋12 h时达到峰值（较鲜叶分别提升36.96%、39.39%、20.13%和11.04%），至萎凋60 h时含量降至最低前，总体呈现下降趋势。

3 讨论

3.1 室内自然萎凋过程中白茶差异代谢物含量的变化规律

在白茶室内萎凋初期，萎凋叶结构完整，酶促氧化发挥作用较小，叶内主要生化成分变化缓慢，随着萎凋时间的延长，失水导致叶细胞的细胞膜透性增强，在各种酶的作用下，更多物质被氧化，这些物质通过聚合、缩合反应，逐步形成双黄烷醇类、茶黄素和茶褐素等复杂产物[24-25]。在萎凋过程中，单体儿茶素类物质含量呈下降趋势，特别是萎凋后期含量显著下降，这与陈静等[17]和王丽丽等[26]的研究结果一致，Wang等[18]发现单体儿茶素在萎凋过程中的含量变化与PAL、C4H、CHI、F3H、F3'H、F3'5'H、DFR、LAR、ANR等关键酶基因表达水平相关。此外，没食子酸在萎凋过程中含量提升，可能是在白茶萎凋后期随着叶细胞的破裂加剧，叶中的水解单宁酶与含没食子酰基多酚接触，催化水解形成EC、EGC等非酯型儿茶素和没食子酸[27-28]。

注：*表示正离子模式下鉴定到的差异代谢物

Note: * differential metabolites identified in positive ion mode

图6 室内自然萎凋白茶过程样的酚酸类物质变化

Fig.6 The changes of phenolic acids in indoor withering white tea

多种山奈酚、槲皮素、芹菜素等黄酮糖苷物质在萎凋过程中，特别是萎凋48 h时含量提升。这类糖苷物质在乌龙茶加工过程中，由于经历了高温处理，导致大部分含量下降[27]，但白茶特殊的加工工艺可能促使更多的儿茶素向黄酮醇糖苷和黄酮糖苷转化，使其保留更多的糖苷物质[29]。此外，Zhang等[30]利用LC-MS比较了5种茶属植物原花青素物质含量变化，认为EC葡萄糖苷在原花青素生物合成上起重要作用，可以和EC、EGC等单体儿茶素物质合成形成原花青素物质，Liu等[31]以豆科模式植物蒺藜苜蓿为研究对象，发现无色花色素还原酶（LAR）可以使4-(-cysteinyl)-epicatechin转化为EC，EC可以作为启动单元进一步合成原花青素，4--(-cysteinyl)-epicatechin是原花青素合成的重要底物，而Wang等[32]则进一步证明了在原花青素合成过程中，黄烷-3-醇碳正离子（Flavan-3-ol carbocations）起到重要作用，它可以作为底物与亲质子的黄烷-3-醇结合形成低聚或多聚的原花青素物质。这些物质可能为单体儿茶素提供了合成原花青素物质的基础，促进3,3'-双没食子酰基原花青素、3,3'-双没食子酰基原飞燕草素B5、聚酯型儿茶素A、聚酯型儿茶素B、聚酯型儿茶素F等多种原花青素与聚酯型儿茶素的含量在萎凋过程中上升。值得注意的是，这类在萎凋过程中含量上升的物质均含没食子酰基，而未含没食子酰基的原花青素B1、B2、B3、C1、聚酯型儿茶素C等物质含量则呈下降趋势，这与Chen等[33]的研究结果不同，该研究发现原花青素B1、B2、B3与聚酯型儿茶素A、聚酯型儿茶素B、聚酯型儿茶素C、聚酯型儿茶素F等均在萎凋过程中含量下降。

注：*表示正离子模式下鉴定到的差异代谢物

Note:* differential metabolites identified in positive ion mode

图7 白茶室内自然萎凋过程的生物碱等5类物质变化

Fig.7 The changes of 5 substances in indoor withering white tea hering white tea

在白茶室内自然萎凋过程中，没食子酸、柠檬酸/异柠檬酸、对香豆酸等6种酚酸物质含量提升，而茶没食子素、奎宁酸、咖啡酸、水杨酸、绿原酸等10种物质呈现下降趋势，且均在萎凋57～60 h时达到最大或最小值。这与Marat等[20]对白茶加工过程中有机酸组分含量测定的研究结果略有不同。本研究中，柠檬酸、没食子酸、绿原酸在白茶加工过程中的含量变化与Marat等[20]的结果一致；而咖啡酸、对香豆酸的含量变化结果相反。此外，咖啡碱含量在萎凋过程中总体上有上升的趋势，而可可碱含量先下降后升高，但总体含量呈下降趋势，这与张应根等[23]和Chen等[33]的结果一致。2种茶氨酸异构体的含量变化趋势也与Chen等[33]的基本一致。

3.2 室内自然萎凋工艺对白茶滋味品质的影响

室内自然萎凋工艺促进了鲜叶中单体儿茶素类物质的氧化，导致其含量降低，同时使部分原花青素与聚酯型儿茶素物质含量提升，单体儿茶素类含量的下降降低了茶汤的苦涩程度，进一步增加了茶汤的醇度，原花青素的提升则增加了茶叶的保健功效，这些物质能够消除超氧阴离子和羟基自由基，保护脂质不发生过氧化损伤，还可螯合金属离子，使其在体内形成惰性化合物，同时还有助于维生素C的吸收和利用[34]。而多种黄酮糖苷物质含量的提升，也促进了白茶滋味的形成，这些物质使茶汤口感具有天鹅绒般的柔软感，虽然丰度远低于单体儿茶素，但其对滋味贡献的阈值比儿茶素类物质低得多，所以其对改善白茶的口感与滋味有重要贡献。同时，这些糖苷物质还具有很强的抗氧化生物活性，对心血管系统有潜在的益处[35]。此外，没食子酸、柠檬酸等酚酸物质含量在萎凋过程中提升，这些酚酸物质是合成酯型儿茶素的前体，随着酯型儿茶素的水解产生，对茶汤的特有滋味和茶叶品质的形成有利，其中含量较高的没食子素也对茶叶鲜爽滋味有较大贡献[36]。

3.3 对白茶生产实践的指导意义

本研究发现，室内自然萎凋过程中，白茶的主要代谢物含量变化以萎凋24 h和萎凋48 h为时间节点，分为萎凋前期（萎凋前24 h）、萎凋中期（萎凋24～48 h）和萎凋后期（萎凋48 h以后）3个阶段。在这3个不同的萎凋阶段，多种同类型代谢物的含量出现较为一致的规律，在萎凋前期，单体儿茶素、香豆素、茶氨酸等物质含量较高，而原花青素物质、聚酯型儿茶素、黄酮糖苷等物质则在萎凋后期达到最高含量。研究发现，4种原花青素物质[ECG- (4->8)-EGCG、ECG-(4->6)-EGCG、3'-没食子酰基原飞燕草素B2和3,3'-双没食子酰基原飞燕草素B5]、6种山奈酚糖苷（山奈酚3--半乳糖苷、山奈酚3--半乳糖基-鼠李糖苷、山奈酚3--葡萄糖基-鼠李糖苷、山奈酚3--新橙皮糖苷/山奈酚-4′′--牡荆素葡萄糖苷、山奈酚-3--芸香糖苷、山奈酚-3--吡喃葡萄糖苷），4种槲皮素糖苷（槲皮素2-没食子酰葡萄糖苷、槲皮素3--半乳糖基-芸香糖苷、槲皮素3--吡喃葡萄糖基-吡喃鼠李糖基-半乳糖苷、槲皮素3--葡萄糖基-鼠李糖基-香豆酰己糖苷），1种芹菜素糖苷（芹菜素6--葡萄糖基8--阿拉伯糖苷）的含量均在萎凋45～48 h时开始大幅提升，57～60 h时含量达到最大值；2,4,6-三羟基苯甲酸甲酯、没食子酸、5--反式香豆酰基奎宁酸异构体1、柠檬酸/异柠檬酸、对香豆酸、1-没食子酰基葡萄糖异构体4等6种酚酸类物质，聚酯型儿茶素A、聚酯型儿茶素B、聚酯型儿茶素F等3种聚酯型儿茶素和咖啡碱等均在萎凋57～60 h时含量达到最大值。张应根等[23]发现在白茶萎凋过程中滋味的形成一直延续到萎凋结束，而上述物质的含量也均在萎凋末期的达到最大，这些物质对于白茶风味的形成可能具有重要价值。此外，本研究还发现，4种香豆素类物质和2种茶氨酸异构体（茶氨酸异构体1、2）的含量均在萎凋12 h时达到峰值。这些对于白茶滋味风味在萎凋过程中的变化起到重要作用。本研究结果明确了白茶加工过程中萎凋时间与品质的关系提供了理论依据，同时也可以为生产某些高含量成分的白茶产品提供技术参考，对白茶的生产实践具有一定的指导意义。

[1] Hashimoto T, Goto M, Sakakibara H, et al.Yellow tea is more potent than other types of tea in suppressing liver toxicity induced by carbon tetrachloride in rats [J].Phytotherapy Research, 2007, 21(7): 668-670.

[2] Wang K, Liu F, Liu Z, et al.Comparison of catechins and volatile compounds among different types of tea using high performance liquid chromatograph and gas chromatograph mass spectrometer [J].International Journal of Food Science & Technology, 2011, 46(7): 1406-1412.

[3] Yang Z, Baldermann S, Watanabe N.Recent studies of the volatile compounds in tea [J].Food Research International, 2013, 53(2): 585-599.

[4] Azman N A M, Peiró S, Fajarí L, et al.Radical scavenging of white tea and its flavonoid constituents by electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy [J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2014, 62(25): 5743-5748.

[5] Carloni P, Tiano L, Padella L, et al.Antioxidant activity of white, green and black tea obtained from the same tea cultivar [J].Food Research International, 2013, 53: 900-908.

[6] Dias T R, Alves M G, Tomas G D, et al.White tea as a promising antioxidant medium additive for sperm storage at room temperature: a comparative study with green tea [J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2014, 62(3): 608-617.

[7] Espinosa C, Lopez-Jimenez J A, Perez-Llamas F, et al.Long-term intake of white tea prevents oxidative damage caused by adriamycin in kidney of rats [J].J Sci Food Agr, 2016, 96(9): 3079-3087.

[8] Hajiaghaalipour F, Kanthimathi M S, Sanusi J, et al.White tea () inhibits proliferation of the colon cancer cell line, HT-29, activates caspases and protects DNA of normal cells against oxidative damage [J].Food Chemistry, 2015, 169: 401-410.

[9] Dias T R, Alves M G, Rato L, et al.White tea intake prevents prediabetes-induced metabolic dysfunctions in testis and epididymis preserving sperm quality [J].J Nutr Biochem, 2016(37): 83-93.

[10] Song J L, Zhou Y L, Feng X, et al.White tea ((L.)) ethanol extracts attenuate reserpine-induced gastric ulcers in mice [J].Food Sci Biotechnol, 2015, 24(3): 1159-1165.

[11] Santana-Rios G, Orner G A, Amantana A, et al.Potent antimutagenic activity of white tea in comparison with green tea in the Salmonella assay [J].Mutation Research, 2001, 495: 61-74.

[12] López V, Calvo M I.White tea (Kuntze) exerts neuroprotection against hydrogen peroxide-induced toxicity in PC12 cells [J].Plant Foods for Human Nutrition, 2011, 66: 22-26.

[13] Wang G, Zhao X.Comparative study on antimutagenic and in vitro anticancer activities between two kinds of white tea and green tea [J].Food Science, 2009, 30: 243-245.

[14] 陈玉春, 王碧英.白茶对小鼠血清红细胞生成素水平的影响[J].茶叶科学, 1998, 18(1): 159-160.

Chen Y C, Wang B Y.Effect of white tea on serum erythropoietin level in mice [J].Journal of Tea Science, 1998, 18(1): 159-160.

[15] 梁丽云.白茶在萎调及贮藏中茶多酚变化的研究[J].贵州茶叶, 2017, 45(2): 9-13.

Liang L Y.Research status on the change of tea polyphenols in the wilting and storage of white tea [J].Guizhou Tea, 2017, 45(2): 9-13.

[16] 陶湘辉, 陈常颂, 林郑和, 等.茶叶EGCG在不同茶类加工过程的变化初探[J].茶叶科学技术, 2010(3): 27-30.

Tao X H, Chen C S, Lin Z H, et al.Preliminary study on the changes of tea EGCG in different tea processing [J].Tea Science and Technology, 2010(3): 27-30.

[17] 陈静, 俞滢, 张丹丹, 等.白茶萎凋过程中儿茶素合成关键酶基因表达分析[J].南方农业学报, 2016, 47(8): 1364-1369.

Chen J, Yu Y, Zhang D D, et al.Expression of genes encoding key enzymes in biosynthesis pathways of catechins in the withering process of white tea [J].Journal of Southern Agriculture, 2016, 47(8): 1364-1369.

[18] Wang Y, Zheng P C, Liu P P, et al.Novel insight into the role of withering process in characteristic flavor formation of teas using transcriptome analysis and metabolite profiling [J].Food Chemistry, 2019, 272: 313-322.

[19] Dai W, Xie D, Lu M, et al.Characterization of white tea metabolome: Comparison against green and black tea by a nontargeted metabolomics approach [J].Food Research International, 2017, 96: 40-45.

[20] Marat T, 张钎, 屈艳勤, 等.白茶加工过程中有机酸组分含量分析[J].福建茶叶, 2019, 41(3): 11-12.

Marat T, Zhang Q, Qu Y Q, et al.Analysis of the content of organic acid components in the processing of white tea [J].Tea in Fujian, 2019, 41(3): 11-12.

[21] 宋振硕, 王丽丽, 陈键, 等.茶鲜叶萎凋过程中游离氨基酸的动态变化规律[J].茶叶学报, 2015, 56(4): 206-213.

Song Z S, Wang L L, Chen J, et al.Changes on free amino acids in fresh tea leaves during withering [J].Acta Tea Sinica, 2015, 56(4): 206-213.

[22] Chen Q, Shi J, Mu B, et al.Metabolomics combined with proteomics provides a novel interpretation of the changes in nonvolatile compounds during white tea processing [J].Food Chem, 2020, 332: 127412.doi: 10.1016/j.foodchem.2020.127412.

[23] 张应根, 陈林, 陈泉宾, 等.白茶自然萎凋过程中风味形成的动态研究[J].茶叶学报, 2016, 57(2): 80-84.

Zhang Y G, Chen L, Chen Q B, et al.Flavor formation of white tea during natural withering [J].Acta Tea Sinica, 2016, 57(2): 80-84.

[24] 李鑫磊, 俞晓敏, 林军, 等.基于非靶向代谢组学的白茶与绿茶、乌龙茶和红茶代谢产物特征比较[J].食品科学, 2020, 41(12): 197-203.

Li X L, Yu X M, Lin J, et al.Comparative metabolite characteristics of white tea with green tea, Oolong tea and black tea based on non-targeted metabolomics approach [J].Food Science, 2020, 41(12): 197-203.

[25] Jiang X L, Liu Y J, Wu Y H, et al.Analysis of accumulation patterns and preliminary study on the condensation mechanism of proanthocyanidins in the tea plant [] [J].Sci.Rep, 2015, 5: 8742.doi: 10.1038/srep08742.

[26] 王丽丽, 宋振硕, 陈键, 等.茶鲜叶萎凋过程中儿茶素和生物碱的动态变化规律[J].福建农业学报, 2015, 30(9): 856-862.

Wang L L, Song Z S, Chen J, et al.Changes on catechin and alkaloid contents in fresh tea leaves during withering [J].Fujian Journal of Agricultural Sciences, 2015, 30(9): 856-862.

[27] 宛晓春, 夏涛.茶树次生代谢[M].北京: 科学出版社, 2015: 49.

Wan X C, Xia T.Secondary metabolism of tea plant [M].Beijing: Science Press, 2015: 49.

[28] Dai X, Liu Y, Zhuang J, et al.Discovery and characterization of tannase genes in plants: roles in hydrolysis of tannins [J].New Phytologist, 2020, 226(4): 1104-1116.

[29] Fraser K, Lane G A, Otter D E, et al.Non-targeted analysis by LC-MS of major metabolite changes during the oolong tea manufacturing in New Zealand [J].Food Chemistry, 2014, 151: 394-403.

[30] Zhang L, Tai Y L, Wang Y J, et al.The proposed biosynthesis of procyanidins by the comparative chemical analysis of five Camellia species using LC-MS [J].Sci Rep, 2017, 7: 46131.doi: 10.1038/srep46131.

[31] Liu C, Wang X, Shulaev V, et al.A role for leucoanthocyanidin reductase in the extension of proanthocyanidins [J].Nat Plants, 2016, 2: 16182.doi: 10.1038/NPLANTS.2016.182.

[32] Wang P, Liu Y, Zhang L, et al.Functional demonstration of plant flavonoid carbocations proposed to be involved in the biosynthesis of proanthocyanidins [J].The Plant Journal, 2019, 101(1): 18-36.

[33] Chen Q, Shi J, Mu B, et al.Metabolomics combined with proteomics provides a novel interpretation of the changes in nonvolatile compounds during white tea processing [J].Food Chemistry, 2020, 332: 127412.doi: 10.1016/j.foodchem.2020.127412.

[34] 白鸿.保健食品功效成分检测方法[M].北京: 中国中医药出版社, 2011: 71.

Bai H.Testing method for functional components of health food [M].Beijing: China Press of Traditional Chinese Medicine, 2011: 71.

[35] Wu C, Xu H, Héritier J, et al.Determination of catechins and flavonol glycosides in Chinese tea varieties [J].Food Chemistry, 2012, 132(1): 144-149.

[36] 宛晓春.茶叶生物化学[M].3版.北京: 中国农业出版社, 2007: 180-184.

Wan X C.Tea biochemistry [M].3rd ed.Beijing: China Agriculture Press, 2007: 180-184.

Analysis of Metabolite Changes in the Natural Withering Process of Fu′an White Tea Based on Non-targeted Metabolomics Approach

YUE Wenjie1,2,3, JIN Xinyi2*, CHEN Mingjie4*, YE Naixing2, GUO Li5, ZHAO Feng6

1.Jinshan College, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China; 2.College of Horticulture, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China; 3.FAFU-UCR Joint Center/Horticultural Plant Biology and Metabolomics Center, Haixia Institute of Science and Technology, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China; 4.College of Life Sciences, Xinyang Normal University, Xinyang 464000, China; 5.Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310008, China; 6.School of Pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, China

In this study,cv Fu'an Dabai was used as materials to make white tea following the standard indoor natural withering procedure.Samples were collected every 3 h, and non-targeted metabolomics was used to analyze tea metabolite changes.Principal component analysis (PCA) shows that metabolite contents in fresh leaves showed regular dynamic changes during the process of indoor natural withering of white tea.Totally 109 metabolites with significant difference were identified and showed 5 major patterns.These patterns could be divided into four stages: 24 h before withering, 24-48 h during withering, 48-57 h during withering and after 57 h.According to their structure, these metabolites can be classified into 4 types.The 8 monomer catechins (Catechins) showed a downward trend during the withering process.The contents of 18 proanthocyanidins (PAs) and 5 Theasinensins (TSs) showed different trends.The galloyl containing PAs and TSs showed an upward trend, while non- galloyl containing PAs and TSs showed an opposite trend.For glycoside derivatives, 6 kaempferol glycosides, 4 Quercetin (quercetin) glycoside and 1 apigenin glycoside showed an upward trend.Their contents increased significantly after 48 h withering.In the process of withering, 5 of the 12 phenolic acids showed an upward trend.While the rest 7 showed a downward trend.All of them reached their peaks or bottom at 57-60 h.In addition, 22 different metabolites including alkaloids, amino acids, peptides, coumarins, sugars, etc.were also identified.Caffeine showed an upward trend.Their contents reached the peaks at 60 h.Theobromine decreased significantly in the mid-withering period, and slightly recovered in the latter period.The contents of 2 theanine isomer and 4 coumarins rose to the peak at 12 h.After that, there was an overall downward trend during the withering process.These data offered important insights for understanding the biosynthesis and regulation mechanism of white tea during indoor natural withering process.

white tea,natural withering, non-targeted metabolomics, metabolites

S571.1；TS272.5+9

A

1000-369X(2021)03-379-14

2020-08-17

2020-11-11

国家自然科学基金（31270735）、福建省教育厅中青年教师教育科研项目（JAT170885）、福建农林大学科技创新专项基金（CXZX2016117）、福建农林大学金山学院青年教师科研基金立项项目（z170701）

岳文杰，男，讲师，主要从事茶叶加工与茶叶资源利用方面研究。*通信作者：jxy427@fafu.edu.cn；mjchen@xynu.edu.cn

（责任编辑：赵锋）