杨可心，陈秀叶，刘畅，鹿秀云，郭庆港*，马平

（1.河北省农林科学院植物保护研究所/河北省农业有害生物综合防治工程技术研究中心/农业农村部华北北部作物有害生物综合治理重点实验室，河北 保定071000；2.南京农业大学植物保护学院，南京210095）

由尖孢镰刀菌萎蔫专化型（Fusarium oxysporumf.sp.vasinfectum）引起的棉花枯萎病是棉花生产上的主要病害之一，给棉花生产造成严重损失[1]。种植抗病品种是防治棉花枯萎病的有效措施之一[2]，但近年来田间调查发现，棉花枯萎病发生提前，并且存在越来越重的趋势，推测可能与病原菌的遗传分化有关。

根据在不同寄主上的致病力强弱，棉花枯萎病菌被划分为8个不同的生理小种，1号和2号生理小种分布在美国和坦桑尼亚[3]，3号生理小种分布在埃及、以色列、苏丹和我国新疆的个别地区[4]；4号生理小种最初在印度被发现，2001年在美国的加州地区也发现了1株强致病力棉花枯萎病菌，通过致病力测定和分子检测技术，该菌株被鉴定为4号生理小种[5]。5号生理小种分布于苏丹，对海岛棉有侵染性，对陆地棉无侵染作用[6]；6号生理小种存在于巴西，其致病力与1、2号生理小种相似。7号和8号生理小种存在于中国，并且7号生理小种致病力较强，是我国的优势生理小种[7]。除了上述8个明确的生理小种外，在澳大利亚存在一类独特的生理型菌株。澳大利亚生理型菌株致病力较强，对澳大利亚大部分棉花品种表现较强的致病力，给当地棉花生产造成严重的经济损失。通过多基因序列比对发现，澳大利亚生理型菌株是由澳大利亚本土起源[8]。近年来，随着测序技术的快速发展，国内外相继分离出几个具有不同遗传背景的生理型菌株[9]。

尖孢镰刀菌产生植物毒素导致植物萎蔫是其致病的主要机理之一。尖孢镰刀菌可以产生多种植物毒素，包括镰刀菌酸（Fusaric acid）、白僵菌素（Beauvericin）、苯乙酸（Phenylacetic acid）[10-11]，其中镰刀菌酸是棉花枯萎病菌产生的主要毒素，引起棉花植株萎蔫症状，阻断镰刀菌酸合成后可以显著降低棉花枯萎病菌的致萎能力[12-13]。棉花枯萎病菌不同生理小种之间毒素的种类以及镰刀菌酸的产量不同[14]。

Guo等对采自我国主要植棉区的棉花枯萎病菌进行遗传多样性分析，发现我国棉花枯萎病菌存在不同于3号、7号和8号生理小种的新生理型菌株；进一步通过看家基因序列比对，证明这类新生理型菌株与澳大利亚生理型菌株亲缘关系较近；致病力测定表明，新生理型菌株对我国主要的棉花品种致病力较弱[9]。本研究的目的包括：（1）明确棉花枯萎病菌新生理型菌株、7号生理小种以及澳大利亚生理型菌株产生的主要毒素种类以及产量差异；（2）采用离体叶片法评价毒素的致病力。本研究结果将进一步加深对新生理型菌株的了解，为新生理型菌株致病力长期监测及防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

棉花枯萎病菌新生理型H70菌株采自河北省威县，通过扩增片段长度多态性（Amplified fragment length polymorphism，AFLP）分析以及多基因序列比对，证明该菌株不同于我国已发现的3号、7号和8号生理小种，而与澳大利亚生理型菌株亲缘关系较近[9]。7号生理小种由河北省农林科学院植物保护研究所植物病害生物防治实验室分离并保存提供，澳大利亚生理型菌株ATCC96291购自美国菌株保存中心（American Type Culture Collection，ATCC）。

1.2 棉花枯萎病菌不同菌株形态学观察

将棉花枯萎病菌7号生理小种、H70及澳大利亚生理型菌株ATCC96291菌株接种在马铃薯葡萄糖琼脂（Potato dextrose agar，PDA）培养基（pH 5.5）上，25℃条件下培养5 d，观察不同菌株的形态。将3株棉花枯萎病菌在马铃薯葡萄糖液体（Potato dextrosebroth，PDB）培养基（pH 5.5）中，25℃、160 r·m in－1下震荡培养5 d，培养液在10000 r·m in－1下离心10min，观察上清液的颜色。

1.3 棉花枯萎病菌不同菌株在不同温度下生长情况比较

将供试菌株接种在PDA培养基上，在25℃条件下培养5 d，挑取菌落边缘相同大小的菌饼于PDA培养基上，分别置于20℃、25℃、30℃和35℃温度梯度下培养，每个温度3次重复，7 d后利用十字交叉法测量菌落平均直径，观察菌株在不同温度下的生长差异。

1.4 棉花枯萎病菌不同菌株孢子形态观察

将供试菌株接种在绿豆汤培养基（pH 6.0）[15]中，25℃、160 r·m in－1下震荡培养5 d，经4层纱布滤去菌丝，制成孢子悬浮液，在显微镜下观察孢子形态。

1.5 棉花枯萎病菌毒素的提取

将棉花枯萎病菌菌株H70、7号生理小种和ATCC96291分别接种到PDA培养基上，25℃黑暗培养7 d，切取菌落边缘直径为6 mm的菌饼，放入100 m L察氏培养基[16]中，25℃、120 r·min－1振荡培养15 d。培养液4层纱布过滤，过滤液3 000 r·m in－1下离心30 m in。上清液再次用3层滤纸过滤，收集滤液。将滤液置于65℃水浴30 min，得到粗毒素。取粗毒素50 m L，用1 mol·L－1的HCl调pH至2.5，用10 m L乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，45℃旋转蒸发去除有机相。蒸干后的残留物用色谱级甲醇溶解并调整质量浓度为20 g·L－1，然后用孔径为0.45μm的过滤器过滤得到毒素提取液，置于4℃冰箱中保存备用。

1.6 毒素的高效液相色谱分析

利用Waters-2695高效液相色谱仪（美国Waters公司）对毒素提取液进行分离、检测。色谱柱为Agilent TC-C18（柱长250 mm，直径4.6 mm，填料粒径5μm），流动相A相为0.5%（质量分数）K2HPO4·3H2O溶液（使用前，用浓H3PO4将其pH调节至7.34），流动相B相为甲醇。梯度洗脱程序：0～20 m in，流动相B从50%（体积分数）逐渐提高到75%；20～25 m in，流动相B从75%逐渐降低到50%。流速为1 m L·m in－1，检测波长为268 nm。镰刀菌酸标准品（Sigma公司）用甲醇溶解并配制成质量浓度为10～1 000 mg·L－1的系列稀释液，按照质量浓度从低到高的顺序连续进样，以进样镰刀菌酸标准品的质量浓度为横坐标（x），以检测到的峰面积为纵坐标（y）绘制标准曲线，得到回归方程。对3个菌株的毒素提取物进行液谱分析，根据峰面积大小计算每个菌株镰刀菌酸的产量[17]。收集3个菌株毒素提取液中的特异性物质，浓缩后进行质谱鉴定。

1.7 毒素的质谱分析

采用液质联用仪（Triple TOF 5600，美国AB公司）对毒素中特异性物质进行鉴定。液相色谱柱为Shim-pack GIST C18（柱长100 mm，直径2.1 mm，填料粒径2μm），流动相A相为H2O，流动相B相为乙腈，洗脱条件为0～0.5 m in，流动相B为10%；0.5～1.5 m in，流动相B从10%提升到40%；1.5～2.5 m in，流动相B从40%升到95%；2.5～3.5 m in，流动相B为95%；3.5～3.6 m in，流动相B从95%降到10%；3.6～5.0 m in，流动相B为10%。流速：0.4 m L·m in－1，柱温：40℃，进样量：2μL。质谱条件：采用电喷雾电离源（Elaectrospray ionization，ESI），正离子扫描方式；检测方式为飞行时间全扫描质谱和二级质谱（TOF MS IDA MS-MS）模式。电喷雾电压为5 500 V，离子源温度为500℃。TOF-MS扫描范围的质核比（m/z）为20～500；触发二级扫描范围的m/z为30～500。

1.8 棉花枯萎病菌粗毒素对棉花叶片的致萎能力

采集健康一致的棉花叶片（冀棉11，对枯萎病敏感品种），用清水冲洗干净。将棉花叶片置于含有水琼脂的培养基中，用无菌针头将叶片刺破，每个伤口滴加20μL（20 g·L－1）的粗毒素。将培养皿置于培养箱中25℃黑暗培养，3 d后测量病斑面积。设置20 g·L－1的镰刀菌酸标准品作为阳性对照，甲醇为阴性对照，每个处理4个重复[18]。

1.9 不同类型土壤中棉花枯萎病菌致病力测定

分别从河北省保定市定兴县、邯郸市成安县和沧州市黄骅市的棉田中采集浅层土（去除表层土后，采集地下20 cm以内的土壤）。土壤样品的理化性质（pH、电导率及有机质、全氮、全磷、全钾、速效钾、速效磷含量）由青岛横立检测有限公司测定。将供试土壤和蛭石过筛按体积比1∶1充分混匀，121℃灭菌1 h，晾凉后再重复灭菌1次。将棉花枯萎病菌孢子悬浮液与土壤充分混匀，使土壤中孢子的含量达到106g－1。冀棉11种子经表面消毒后，于25℃下催芽，将露白的棉种播种到混有枯萎病菌的培养基质中，25℃恒温室内培养（12 h光照，12 h黑暗）。播种20 d后调查棉花枯萎病的发病情况，计算病情指数[9]。

2 结果与分析

2.1 棉花枯萎病菌培养性状比较

比较了H70、7号生理小种和ATCC96291在PDA培养基上的形态差异。结果表明，7号生理小种和H70均能形成明显的气生菌丝，而ATCC96291气生菌丝较少（图1）。在PDB培养基上25℃、160 r·m in－1震荡培养5 d后，7号生理小种产生淡褐色（紫色）的色素，但H70和ATCC96291均没有色素产生，且7号生理小种培养液的上清液呈淡粉色，H70和ATCC96291的上清液均无色素产生（图2）。

图1 棉花枯萎病菌菌株H70、7号生理小种（Race7）、ATCC96291的气生菌丝观察Fig.1 Aerial hypha of strains H70,race 7 and ATCC96291 of Fusarium oxysporum f.sp vasinfectum

图2 棉花枯萎病菌菌株H70、7号生理小种（Race7）、ATCC96291的菌落形态及上清液观察Fig.2 Morphology and supernatantof strains H70,race 7 and ATCC96291 of Fusarium oxysporum f.sp vasinfectum

进一步比较了H70、7号生理小种和ATCC96291在不同温度下的生长情况。结果表明，3个菌株在25～30℃生长最好，7 d后菌落直径达到3.4～4.2 cm，在35℃下不能生长。在20℃下，7号生理小种生长较快，而H70生长较慢；但在25℃和30℃下，H70和ATCC96291菌株生长较快，7号生理小种生长较慢（图3）。

2.2 3株棉花枯萎病菌孢子形态比较

观察3株棉花枯萎病菌在绿豆汤培养基中形成的孢子形态，结果（图4）发现，7号生理小种形成的分生孢子以双核小型孢子为主，孢子大小为（10～15）μm×（3～5）μm，存在少数多核大型孢子[（30～35）μm×（3～5）μm）]。H70菌株形成的分生孢子均为单核的小型分生孢子，孢子大小为（10～15）μm×（3～5）μm。而ATCC96291菌株形成的分生孢子均为大型分生孢子，孢子多核，大小为（30～35）μm×（3～5）μm。

图3 棉花枯萎病菌菌株H70、7号生理小种、A TCC96291菌株在不同温度下生长情况Fig.3 Grow th of strains H70,race 7 and ATCC96291 of Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum under different temperatures

图4 棉花枯萎病菌7号生理小种、H70、ATCC96291菌株的孢子形态观察Fig.4 The morphological features of strains H70,race 7 and ATCC96291 of Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum

2.3 3株棉花枯萎病菌毒素的色谱分析

利用液相色谱对棉花枯萎病菌新生理型菌株H70、7号生理小种和ATCC96291的毒素提取液进行分析。结果（图5）显示，3个菌株的毒素提取物中均存在1种特异性物质，保留时间为6.5 min，且该特异性物质与镰刀菌酸具有相似的保留时间。由此推断，3个菌株均产生镰刀菌酸。

2.4 3株棉花枯萎病菌毒素的质谱分析

以镰刀菌酸作为对照，进一步利用液质联用仪对3株枯萎病菌中经液谱分离获得的特异性物质进行质谱分析。结果（图6）显示，H70、7号生理小种和ATCC96291毒素提取液中的特异性物质m/z均为180.1，与镰刀菌酸标准品的m/z相同，并且3个菌株毒素提取物中的特异性物质与镰刀菌酸标准品的二级质谱图相同。结果证明，3株棉花枯萎病菌均可产生镰刀菌酸。

2.5 3株棉花枯萎病菌毒素含量分析

3株棉花枯萎病菌具有相同的生长速率（结果未列出）。利用镰刀菌酸标准品构建了基于峰面积和镰刀菌酸质量浓度的标准曲线，结果发现，镰刀菌酸质量浓度在10～1 000 mg·L－1范围内与峰面积具有较高的线性关系（y＝16 635x＋51 237，R2＝0.999）。根据此标准曲线，比较了3个菌株毒素提取物中镰刀菌酸的质量浓度。结果表明，镰刀菌酸的产量在3个菌株之间存在显著性差异（表1）。棉花枯萎病菌7号生理小种毒素提取物中镰刀菌酸的质量浓度最大，为1 259.32 mg·L－1；ATCC96291毒素提取物中镰刀菌酸的质量浓度次之，为778.32 mg·L－1；而H70毒素提取物中镰刀菌酸的质量浓度最小，为135.18 mg·L－1。上述结果证明，7号生理小种产生的镰刀菌酸最多，而H70产生的镰刀菌酸最少。

2.6 3株棉花枯萎病菌毒素的毒力检测

将质量浓度为20 g·L－1的毒素采用叶片穿刺的方法接种于棉花叶片上，以20 g·L－1镰刀菌酸为阳性对照，以甲醇和察氏培养基为阴性对照。结果显示，镰刀菌酸能引起棉花叶片发生大面积的萎蔫坏死，3个菌株的毒素提取液均能导致棉花叶片出现病斑，其中7号生理小种毒素提取液处理的病斑面积最大，其次是ATCC96291，而H70的毒素对棉花叶片的毒力最小（图7）。

2.7 棉花枯萎病菌在不同土壤中的致病力测定

对采自黄骅市、定兴县和成安县的土壤进行理化性质检测，结果（表2）表明，黄骅市土壤碱性最强，有机质含量较低；定兴县的土壤为轻壤土，有机质含量较高；成安县的土壤为褐土，土壤养分中等。

图5 毒素提取液的高效液相色谱分析Fig.5 HPLC analysis of the toxins extracted from Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum

图6 镰刀菌产生的毒素提取物中特异性物质的质谱分析Fig.6 Mass spectrum analysis of the specific com pound in toxin extracts of Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum

表1 镰刀菌酸的产量比较Table 1 Production of the fusaric acid in the toxin extracts of Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum

利用感病品种冀棉11测定7号生理小种和菌株H70在不同地区土壤中的致病力，结果（图8）表明，在3种不同类型土壤中，7号生理小种比H70的致病力更强。7号生理小种在定兴县和成安县的土壤中致病力较强，病情指数分别为68.2和59.3，在黄骅偏碱性土壤中的致病力较弱，病情指数为34.6。H70在成安县和定兴县土壤中的致病力较高，病情指数分别为32.0和29.3，在黄骅市土壤中的致病力较弱，病情指数为21.4。

3 讨论

图7 棉花枯萎病菌毒素致病力测定Fig.7 Pathogenicity ofthe toxin extracts from Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum

表2 供试土壤理化性质Table 2 Physical and chem ical properties of the tested soils

图8 棉花枯萎病菌7号生理小种和新生理型菌株H70在不同土壤中的致病力Fig.8 Pathogenicity of Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum race 7 and strain H70

棉花枯萎病是由尖孢镰刀菌萎蔫专化型引起的棉花土传病害。棉花枯萎病菌通过产生纤维素酶[19]和植物毒素[14]而引起棉花叶片萎蔫，植物生长缓慢，其中产生植物毒素是棉花枯萎病菌主要的致病机制。植物毒素会破坏植物细胞原生质膜的透性，造成细胞内电解质外渗，植物吸水困难而呈现萎蔫[20]。另外，毒素还可以抑制植物防御反应和呼吸活性，降低植物对逆境的抗性，从而导致植物生长缓慢甚至死亡[21-22]。澳大利亚生理型菌株和4号生理小种分别对澳大利亚和美国的棉花生产造成严重的产量损失，目前已经明确镰刀菌酸是澳大利亚生理型菌株和4号生理小种主要致病因子[23]。我国棉花枯萎病菌存在3号、7号、8号生理小种，最近研究发现我国存在不同于3号、7号和8号生理小种的新生理型菌株，命名为H70，该菌株与澳大利亚生理型菌株具有更加紧密的亲缘关系[9]。本研究首先比较了7号小种、新生理型菌株H70和澳大利亚生理型菌株ATCC96291的培养性状。结果发现，在PDB培养基中，7号小种可以产生淡褐色色素，而H70和ATCC96291菌株均不能产生色素。Bridge等研究发现，在含有七叶苷（Aesculin）的培养基中，2号、3号和4号枯萎病菌小种可以产生七叶素（Aesculetin），从而使培养基呈现深红色，而1号小种和来自非洲的棉花枯萎病菌不能将七叶苷转化为七叶素[24]。关于H70菌株和ATCC96291菌株是否可以将七叶苷转化为七叶素需要进一步研究。尖孢镰刀菌在无性阶段产生多核的大型分生孢子和单核的小型分生孢子，其中大型分生孢子在其分类鉴定中具有重要意义[25]。本研究比较了7号小种、新生理型菌株H70和澳大利亚生理型菌ATCC96291产生分生孢子的形态，结果发现，ATCC96291菌株产生多核的大型分生孢子，7号小种产生多核和双核的大型分生孢子，而新生理型菌株H70主要产生单核的小孢子。据此推测，分生孢子的形态可能是新生理型菌株的重要分类依据之一。为了明确新生理型菌株H70产生的毒素种类，本研究对棉花枯萎病菌该菌株、7号生理小种和澳大利亚生理型菌株ATCC96291的毒素提取物进行了液相色谱和质谱分析，发现3株棉花枯萎病菌产生的毒素具有一致的保留时间和相对分子质量，通过与镰刀菌酸标准品进行比较，证明3株棉花枯萎病菌均产生毒素镰刀菌酸。

棉花枯萎病菌不同生理小种产生的镰刀菌酸产量不同，并且镰刀菌酸的致病力与其产量正相关[26]。澳大利亚生理型菌株具有较强的致病力，对澳大利亚主要的栽培品种表现较强的致病力。研究发现，澳大利亚生理型菌株可以产生大量的镰刀菌酸，并且致病力不同的菌株之间，镰刀菌酸的含量有所差异，即镰刀菌酸的产量与菌株的致病力相关[14]。本研究选用的7号生理小种表现强致病力，而新生理型菌株呈现弱致病力，澳大利亚标准菌株呈现中等致病力。为了明确不同菌株的致病力是否与其产生的镰刀菌酸产量相关，本研究定量比较了3个菌株产生的镰刀菌酸的产量，结果发现，7号生理小种的镰刀菌酸产量最高，而新生理型菌株产生的镰刀菌酸产量最低，不同菌株的致病力与其镰刀菌酸产量呈现正相关。本研究还采用叶片穿刺法检测3株棉花枯萎病菌产生的毒素对棉花叶片的致病力，结果显示其毒素均可以使棉花叶片出现病斑，7号生理小种的毒素造成的病斑面积最大，而新生理型菌株的毒素造成的病斑面积最小。该结果同样证明镰刀菌酸是棉花枯萎病菌主要的致病因子，其菌株的致病力强弱与其产生的镰刀菌酸产量相关。

棉花枯萎病菌通过分泌植物毒素，不仅影响棉花的正常生长，而且抑制棉花根际其他有益微生物的生长，从而利于枯萎病菌在棉花根部的侵入和定植。而棉花根部存在大量的有益微生物，不仅可以抑制枯萎菌的生长，还可以降解植物毒素，缓解植物的中毒症状，从而发挥生物防治的效果[27]。尖孢镰刀菌番茄专化型（F.oxysporumf.sp.lycopersici）通过分泌镰刀菌酸而引起番茄萎蔫。Toyoda获得1株能降解镰刀菌酸的无致病性的青枯病菌（Pseudomonassolanacearum），该细菌处理番茄根际后能有效缓解尖孢镰刀菌引起的番茄萎蔫症状[28]。棉花枯萎病菌4号生理小种可以产生大量的镰刀菌酸，对美国大部分主栽棉花品种表现较强的致病力，给美国棉花生产造成严重的经济损失。研究发现，根际的真菌鲁氏毛霉（Mucorrouxii）可以将镰刀菌酸代谢为8-羟基镰刀菌酸，后者对棉花的致病力较低。因此，棉花根部施用鲁氏毛霉可以防治枯萎病。因此，明确了棉花枯萎病菌毒素种类，可以有目的地筛选降解毒素的微生物，用于创制新型微生物杀菌剂[12]。本研究明确了棉花枯萎病菌7号生理小种和新生理型菌株H70产生的植物毒素为镰刀菌酸，可以筛选有效降解镰刀菌酸的微生物，从而有针对性地开发防治棉花枯萎病的微生物杀菌剂。

本研究所用的新生理型菌株H70与澳大利亚生理型菌株ATCC96291具有较近的亲缘关系。前期研究评价了新生理型菌株对海岛棉匹马90以及陆地棉冀棉11、冀棉169和中植棉2号的致病力，发现同7号生理小种相比，H70的致病力较弱[9]。澳大利亚菌株ATCC96291对澳大利亚所有的棉花品种均表现出较高的致病力，并且在偏碱性的土壤中致病力较强[8]。因此，本研究进一步评价了新生理型菌株H70和7号生理小种在不同土壤中的致病力。结果发现，相比7号生理小种，H70在3中不同类型土壤中的致病力均较弱；随着土壤碱性的增强，7号生理小种和H70的致病力均降低，且后者较前者降低更缓慢，推测H70菌株较7号生理小种对碱性土壤的适应能力可能更强。

4 结论

棉花枯萎病菌新生理型菌株H70不能形成淡褐色色素，形成的气生菌丝较多，产生单核的小型分生孢子。H70、7号小种和澳大利亚生理型菌株ATCC96291均产生镰刀菌酸，7号生理小种产生的镰刀菌酸含量最高，而H70的镰刀菌酸含量最低。镰刀菌酸可以引起棉花叶片出现坏死症状，并且病斑大小与镰刀菌酸的含量呈正相关性。新生理型菌株在3种不同类型土壤中的致病力均较低。