孙璘，海艳，唐晓雪，祖丽皮亚·艾买，焦瑞莲，任毓忠*，李国英*

（1.石河子大学农学院/新疆绿洲农业病虫害治理与植保资源利用重点实验室，新疆石河子832003；2.石河子市种子管理站，新疆 石河子832000）

2016年以来，在新疆棉花上发现了1种引起棉花茎秆腐烂的病害，对病部进行镜检，发现大量镰刀菌分生孢子。该病害在田间主要为害茎秆，严重时往往导致棉花整株枯死。

国内外关于棉花茎腐病的报道不多，1975年西安市植保植检站报道的棉花茎腐病病原菌是Phomasp.[1]。1986年李庆基等在《菜豆壳球孢菌与棉花的关系》中提到Macrophom ina phaseoli可导致棉花茎腐病[2]。1996年方中达在《中国农业植物病害》上记载棉花茎腐病病原为Sclerotium rolfsii[3]。2000年Koenning等和Laidou等分别报道Phoma exigua和Alternaria alternata可引起棉花茎腐病的发生[4-5]。以上病原均不是镰刀菌。1977年苏联学者比托普利契科在《栽培作物真菌病原鉴定》一书中报道，爪哇镰孢（F.iavanicum）和黄色镰孢（F.culmorum）可引起棉花茎部病害[6]，但这2个种和本研究发现的新疆棉花茎腐病病原有明显的区别。

镰刀菌是一种分布十分广泛的微生物，不仅可以造成许多农作物的病害，部分镰刀菌还会产生毒素，污染环境，危害人类健康[7]。其对环境的适应能力强，容易变异，导致其种的鉴定存在一定困难[8]。随着分子生物学的不断发展，分子诊断技术已广泛应用于真菌的种类鉴定以及种间遗传分化分析。由于新疆棉花茎腐病病原并未明确，该病害如遇到适宜环境流行并成灾，故本研究通过形态学特征、核糖体内转录间隔区（rDNA-Internally transcribed spacer sequences，rDNA-ITSs）和转录延伸因子1α（Transcriptional elongation factor 1-alpha，TEF-1α）基因序列分析和致病性测定对病原种类进行鉴定，进一步测定病原生物学特性，以期为该病害的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 病害调查、采样和症状描述

该病于2016年8月底在棉田病害普查时发现。于2017年8月下旬和2020年9月中旬分别在南疆阿拉尔棉田及北疆石河子棉田和博尔塔拉蒙古自治州棉田对该病的发生情况进行了初步调查，并在11个地点对典型病样进行了采集、拍照和症状描述。

1.2 病原的分离、纯化和代表性菌株的选择

将南北疆棉田所采18个病样的茎秆经流水冲洗12 h，晾干后于超净工作台内用灭菌解剖刀在发病与健康部位交界处直接切取5 mm×5 mm的病样，在质量分数为0.1%升汞中浸泡20 s后用无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干，然后置于马铃薯蔗糖琼脂（Potato sucrose agar，PSA）培养基上，恒温25℃暗培养3 d。根据采集地点、菌落特点和形态特征选取20个代表性菌株（表1）进行单孢纯化并于PSA培养基上4℃保存待用。

1.3 病原的鉴定

1.3.1形态学鉴定。按照Booth[7]、Nelson等[8]和Leslie等[9]的分类系统对镰刀菌各形态特征进行归纳汇总，结合王拱辰等发表的《常见镰刀菌鉴定指南》[10]对病原进行形态学鉴定。依据大分生孢子的形态特征，小分生孢子的有无、形态和着生方式，分生孢子梗的特征，厚垣孢子的有无，菌落的颜色特征及其生长速率进行鉴定。将20个菌株分别移接至PSA和合成低营养琼脂（Synthetic low nutrient agar，SNA）（KH2PO41 g、KNO31 g、KCl 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、葡萄糖0.2 g、蔗糖0.2 g、琼脂20 g、蒸馏水1 L）培养基上。在PSA培养基上恒温25℃暗培养5 d后观察其菌落形态，7 d后分别测量50个大分生孢子、50个小分生孢子和50个厚垣孢子；在SNA培养基上，观察大、小分生孢子形态及分生孢子梗和分生孢子的着生状态，并拍照。

表1 代表性菌株样品编号及其采集时间和地点Table 1 Number,collection time and location of the strain sam ples

1.3.2分子生物学鉴定。将20个供试菌株在PSA培养基上培养7 d后，用无菌解剖刀将其菌丝刮至2 m L离心管中。使用Bio Flux真菌DNA提取试剂盒提取供试菌株的基因组DNA。使用镰刀菌属rDNA-ITSs特异性引物（ITSF、ITSR）、真菌ITSs区（ITS1、ITS4）和TEF1α（TEF-lαF、TEF-1αR）的通用引物（表2）对供试菌株DNA进行聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）扩增。反应程序均为94℃预变性5 m in，94℃变性40 s，58℃退火40 s，72℃延伸30 s，35个循环，72℃再次延伸7 m in。PCR产物经质量分数为1%琼脂糖凝胶电泳检测后送至上海生工生物有限公司测序。测序结果至BLAST比对和分析，下载相似性高且同时含有rDNA-ITS和TEF-1α基因的镰刀菌属（Fusariumspp.）参考菌株的序列。按照rDNA-ITS和TEF-1α的顺序依次拼接，并以棉花黄萎病病原菌大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）为外群，使用MEGA5.0软件中邻接法（Neighbor-joining method）构建系统发育树，参数设置如下：Bootstrap method（Test of phylogeny）检验迭代1 000次，Maximum composite likelihood（substitution model），Uniform rates（Rates among sites），Complete deletion（Gaps/m issing data treatment），1st＋2nd＋3rd＋non-coding（codons included）。

表2 引物及其序列信息Table 2 Primers and their sequence information

1.3.3致病性测定。致病性测定选用棉花品种均为石惠16号，接种时期为花铃期，接种区三面均为棉花，一面为道路，确定周围没有造成类似症状的污染源和工厂。以形态学鉴定和分子生物学鉴定为基础，选取2种代表性菌株F3和F11，分别代表F.proliferatum和F.incarnatum，用喷雾法和菌丝块法接种，进行致病性测定。喷雾接种：按照常规方法配制孢子含量1×107m L－1孢子悬浮液，在田间分别用无伤、有伤（针刺）[14]对茎秆和棉铃进行接种，然后套袋保湿72 h，每组处理15个茎秆和棉铃，以不接种的茎秆和棉铃为对照。定期调查发病情况，比较不同接种方法的发病症状。菌丝块接种：在菌落边缘取直径5 mm的菌饼，分无伤、有伤（针刺）接种到茎秆和棉铃上，每组处理15个茎秆和棉铃，以不接种茎秆和棉铃为对照。持续观察15 d，比较不同接种方法的发病症状。另外，对棉花苗期进行致病性测定，所用棉花品种为新陆早66号，在幼苗长至3～5叶期采用针刺喷雾接种茎秆，接种孢子含量和上述相同，接种1个月后，观察茎秆发病情况，以未接种的茎秆为对照。发病后对显症部位进行再分离，观察再分离菌株与接种菌株异同。

1.4 2种镰刀菌生物学特性观察试验

1.4.1温度试验。2种镰刀菌培养6 d后，在无菌条件下从菌落的边沿用灭菌打孔器打成直径5mm的菌饼，供如下生物学特性测定使用。分别将2种镰刀菌菌饼移接至PSA培养基上，置于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃和35℃的恒温箱中进行黑暗培养。5 d后测量菌落直径并拍照。7 d后测定产孢量，即分别在F.incarnatum和F.proliferatum的培养皿中加入1 m L和5 m L无菌水，充分混合均匀，得到孢子悬浮液，然后用血球计数板按常规操作测定产孢量。每种处理设置3个重复。

1.4.2光照试验。将2种镰刀菌菌饼移接至PSA培养基上，分别放入全黑暗、全光照和光暗交替（12 h∶12 h）3种处理的恒温箱中，25℃恒温培养。5 d后测量菌落直径并拍照，7 d后使用血球计数板按常规方法测定产孢量。每种处理设置3个重复。

1.4.3pH试验。用HCl和NaOH将PSA培养基的pH分别调为4、5、6、7、8、9、10，将2种镰刀菌菌饼移接至不同pH的PSA培养基上，25℃恒温黑暗培养。5 d后测量菌落直径并拍照，7 d后使用血球计数板按常规操作测定产孢量。每种处理设置3个重复。

1.4.4培养基试验。将2种镰刀菌菌饼分别移接至PSA培养基、马铃薯葡萄糖琼脂（Potato dextrose agar，PDA）培养基、（索莱宝）麦芽汁琼脂（Malt extract agar，MEA）培养基、SNA培养基、VBC培养基[15]、燕麦琼脂（Oatmeal agar，OA）培养基、玉米粉琼脂（Corn meal agar，CMA）培养基上，25℃恒温黑暗培养。5 d后测量菌落直径并拍照，7 d后使用血球计数板按常规操作测定产孢量。每种处理设置3个重复。

1.4.5致死温度测试。将2种病原菌分别配制成孢子含量1×107m L－1的孢子悬浮液，每离心管中各装入1 m L。分别制取2种病原菌菌饼（直径5 mm），每离心管装入6个。将孢子悬浮液及装有菌饼的离心管分别置于40、45、50、55、60和65℃的恒温水浴锅内处理10 m in。自然冷却至室温后，立即移接至PSA培养基上，并于恒温25℃的人工气候培养箱黑暗培养3 d后，根据病原菌是否生长确定致死温度范围。然后以1℃为间隔设置温度梯度，重复上述步骤，确定致死温度。

1.5 数据分析

各试验处理均为3次重复，数据经MSExcel 2010计算平均值及标准差，使用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析和多重比较[最小显著差数法（Least significant difference，LSD）]。

2 结果与分析

2.1 田间病害调查结果及症状描述

调查查明，该病在南北疆棉田都有发现，虽发生范围较广，但在田间主要呈零星分布，一般在生长比较衰弱的棉株上较易发生。经调查，该病主要侵染棉花植株主茎和侧枝结合部，侵染初期在病部产生褐色的小点，在湿度较大的情况下，病斑扩展较快，并在病部产生一层白色或淡红色粉状的霉层（病征），严重时病部组织崩溃，植株枯死；干燥情况下病斑扩展较慢，甚至停止扩展，不产生霉层，仅为不规则形或梭型的褐色斑点或斑块。

2.2 病原鉴定结果

2.2.1形态学鉴定。分离菌株的主要形态特征：菌落呈棉絮状或羊毛状，初期均为白色至粉红色，后期为浅驼色或淡青莲色；大型分生孢子镰刀状，小型分生孢子纺锤状或卵状。根据采集地点、菌落特点和形态特征选取20个代表性菌株。依据上述特征将其初步确定为镰刀菌属。根据菌落特征、大分生孢子和小分生孢子特征将其分为2类。

本试验通过对精密度、稳定系、重复性进行方法学考察，共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于5%，这一结果表明该方法符合建立中药指纹图谱的技术要求。利用高效液相色谱建立了29个品种的枣叶的物质指纹图谱，标定了14个共有峰，使用中药指纹图谱软件进行分析，结果表明不同样品之间相似度存在差异，根据相似度的大小，可以将不同品种的枣叶的质量分为三个等级。对29个品种枣叶的成分含量进行聚类分析，可将29 批枣叶分为三类，结果与相似度结果一致，说明本文所建立的指纹图谱具有较好的稳定性与重复性，可以用于枣叶的质量控制，为枣叶资源的综合利用提供参考。

第一类：菌株F5、F6、F11～F20在PSA培养基上的生长速率为12.28～13.67 mm·d－1。菌落气生菌丝白色棉絮状，培养初期培养基表面白至粉红，后变浅驼色（图1-A1）。大分生孢子较多，镰刀形、纺锤形，具有明显的足细胞，具3～7个分隔，大小为（10.50～41.99）μm（平均为28.44μm）×（2.77～6.83）μm（平均为4.58μm）（图1-A2）；小分生孢子较少，纺锤形，有时稍弯曲，具0～2个分隔，大小为（6.32～13.21）μm（平均为10.05μm）×（2.32～3.87）μm（平均为3.05μm）（图1-A3）；单瓶梗产孢细胞和多芽产孢细胞并存（图1A4）。厚垣孢子近圆形，大小为（5.75～8.94）μm（平均为7.31μm）×（5.84～9.85）μm（平均为7.51μm）（图1-A5）。形态特征和变红镰刀菌F.incarnatum一致。

第二类：菌株F1～F4、F7～F10在PSA培养基上的生长速率为11.86～13.07 mm·d－1。菌落气生菌丝白色羊毛状，培养初期培养基表面白至粉红，后变淡青莲色（图1-B1）。大分生孢子较少，鳗形或镰刀形，笔直或接近笔直，具3～5个分隔，大小为（19.77～41.83）μm（平均为30.20μm）×（3.21～7.17）μm（平均为4.13μm）。小分生孢子极多，卵形、瓜子形或肾形，具0～1个分隔，大小为（3.92～13.05）μm（平均为8.34μm）×（2.17～3.85）μm（平均为2.98μm）（图1-B2）。产孢细胞单瓶梗和复瓶梗并存，小分生孢子单生或假头状着生（图1-B3），未见厚垣孢子。形态特征和层出镰刀菌F.proliferatum一致。

2.2.2分子生物学鉴定。供试20个菌株采用镰刀菌属特异性引物均可扩增出431 bp的片段，确定均为镰刀菌属。采用真菌通用引物ITS1/ITS4对供试菌株DNA进行PCR扩增，在NCBI进行Blast对比得出：第一类菌株（菌株F5、F6、F11～F20）扩增产物与F.incarnatum（登录号GQ505704.1、GQ505680.1、KF255427.1和KF255432.1）相似性为99.23%～99.81%；第二类菌株（菌株F1～F4、F7～F10）ITS区扩增产物与F.proliferatum（登 录 号KR071679.1、KR071678.1、JX162388.1和JX162373.1）相似性为97.84%～99.79%。菌株rDNA-ITS基因序列长度及其登录号见表3。

采用引物TEF-lαF/TEF-lαR进行扩增，鉴定得出：第一类菌株（F5、F6、F11～F20）扩增产物与F.incarnatum（登录号GQ505615.1、GQ505591.1、KF255470.1和KF255476.1）相似性为91.31%～99.85%；第二类菌株（F1～F4、F7～F10）扩增产物与F.proliferatum（登录号KR071738.1、KR071736.1、JX118998.1和JX118983.1）相似性为99.26%～100.00%。菌株TEF-lα基因片段长度及其登录号见表4。

图1 菌株形态Fig.1 Morphology of the strains

对供试菌株进行ITS/TEF-1α联合序列构建系统发育树（图2）。第一类菌株（F5、F6、F11～F20）均与F.incarnatum聚在同一个分枝上；第二类菌株（F1～F4、F7～F10）均与F.proliferatum聚在同一个分枝上。根据病原菌的形态特征和分子生物学结果确定供试菌株为2类：第一类菌株（F5、F6、F11～F20）为F.incarnatum；第二类菌株（F1～F4、F7～F10）为F.proliferatum。

2.2.3致病性。致病性测定结果表明：F11（F.incarnatum）在无伤接种条件下，采用菌丝块接种茎秆，茎秆接种处产生紫红色或褐色斑点，病斑逐渐扩大至黑褐色，病部凹陷且表皮坏死（图3-B）；有伤接种条件下，分别采用孢子悬浮液和菌丝块接种均可使茎秆和棉铃发病。其发病症状为茎秆和棉铃接种处产生褐色小点，后不断扩大成黑褐色斑点，病部凹陷。另外，菌丝块接种较其孢子悬浮液接种发病早、病情也较重，茎秆病部纵裂导致木质部外露，发病后期在潮湿条件下会产生一层开始白色（菌丝体）后呈粉红色（分生孢子梗和分生孢子）的粉状霉层；干燥情况下，病部则不产生粉红色粉状霉层，严重时茎秆完全枯死（图3-C～F）。接种株症状和田间病株症状一致（图3-A）。菌株F3（F.proliferatum）接种后症状与F11（F.incarnatum）相同。无伤喷雾接种均不发病，对照均不发病。苗期针刺喷雾接种后也明显发病，症状和成株期接种的症状基本相同，对照均不发病。

表3 菌株rDNA-ITS基因序列长度及其登录号Table 3 The length and accession number of rDNA-ITS gene sequence of strains

表4 菌株TEF-lα基因序列长度及其登录号Table 4 The length and accession number of TEF-lαgene sequence of strains

2.3 2种镰刀菌的生物学特性

2.3.1温度对2种镰刀菌生长和产孢量的影响。变红镰刀菌（F.incarnatum）在10～30℃均可生长，在5℃以下和35℃以上不生长。层出镰刀菌（F.proliferatum）在10～35℃均可生长，在5℃以下不生长。在10～25℃下，二者菌落生长速率均随温度升高而加快；高于25℃时，随温度的升高而变慢。两者最适宜生长温度均为25℃左右，在此温度条件下，5 d后菌落直径分别可达62.62 mm和60.28 mm。温度对二者菌落形态影响不大。两者的适宜产孢温度略有不同，且产孢量差异较大。F.incarnatum在15～30℃均可产孢，适宜产孢温度为25～30℃，产孢量可达到1.4×106m L－1；而F.proliferatum在10～35℃均可产孢，最适产孢温度为25℃，产孢量可达到2.56×107m L－1，明显大于F.incarnatum（表5）。

图3 田间与接种发病症状Fig.3 Symptom s of disease in field and inoculation

2.3.3pH对2种镰刀菌生长和产孢量的影响。二者在pH 4～10下均可生长、产孢。其最适生长pH均为8，在此pH下F.incarnatum和F.prolif eratum菌落直径分别可达到63.27 mm和64.97 mm；其最适产孢pH均为7，在此pH下其产孢量分别可达到1.33×106m L－1和1.8×107m L－1（表5）。

2.3.4培养基对2种镰刀菌生长和产孢量的影响。二者在7种供试培养基上均可生长（表5）。F.incarnatum在PDA培养基上生长最快，培养5 d后菌落直径可达67.48 mm；在VBC培养基上生长较慢，培养5 d后菌落直径仅达40.90 mm；最适产孢培养基为PSA，产孢量可达1.27×106m L－1。F.proliferatum在PSA培养基上生长最快，培养5 d后菌落直径可达到64.35 mm；在VBC培养基上生长较慢，培养5 d后菌落直径仅达到48.77 mm；最适产孢培养基为PDA，产孢量可达2.69×107m L－1。二者在CMA培养基上产孢量最小。在VBC和SNA培养基上，两者大分生孢子隔膜更加清晰，顶部和基部更易区分，足细胞更加明显。

2.3.52种镰刀菌的致死温度。将F.incarnatum孢子悬浮液于48℃水浴锅处理10 m in后，孢子不再萌发，因此确定F.incarnatum孢子致死温度为48℃。将含有F.incarnatum的菌饼放入50℃水浴锅处理10 min后，菌丝不再生长，因此确定F.incarnatum菌丝的致死温度为50℃。采用同样方法确定，F.proliferatum孢子的致死温度为60℃，菌丝致死温度为61℃。

表5 不同培养条件（温度、光照、pH）和培养基种类下菌落生长和产孢量的比较Table 5 Comparison of colony grow th and spore production in different culture conditions(tem perature,light,pH)and cultural media

3 讨论

根据柯赫氏法则，初步确定引起新疆棉花茎腐病的病原有2种，即变红镰刀菌（F.incarnatum）和层出镰刀菌（F.proliferatum）。经接种试验还发现，这2种菌不仅可引起茎腐，还可引起棉铃发病。据报道，这2种菌寄主范围都较广泛，不仅可引起植物枯萎、根腐、茎腐、果腐和穗腐等，而且还可产生伏马菌素造成环境污染和人畜疾病[16-18]。国内外主要报道过玉米、水稻、甜瓜等受这2种镰刀菌危害严重[16-18]；但这2种镰刀菌对棉花的危害此前未见报道，因此由其引起的棉花茎腐病是我国首次发现。

经鉴定，供试的20个代表性棉花茎腐病菌株中，有变红镰刀菌12个，占供试菌株60%；有层出镰刀菌8个，占供试菌株40%，说明变红镰刀菌为引起新疆棉花茎腐病的优势菌株。从这2种镰刀菌的形态特征可以看出，本研究中的F.incarnatum与王燕等[18]在甜瓜果腐病上所分离的该种镰刀菌在形态上较一致，差异在于本研究供试菌株可以产生厚垣孢子；Wonglom等[19]报道的哈密瓜果腐病菌F.incarnatum虽可产生厚垣孢子，但其大分生孢子稍弯且足细胞较细长：这些形态差异可能与寄主和环境不同有关。F.proliferatum形态特征与Nelson等[8]报道一致。另外，南疆阿拉尔棉区所采3个菌株均为F.proliferatum，那么是否意味着南疆棉花茎腐病的病原以此为主？因采样较少，这有待今后研究验证。

由于镰刀菌的培养特性变化较大，培养时又存在不产孢或性状不典型等现象，特别是一些形态上相近的种，仅从形态鉴定存在一定困难，因此需要结合分子生物学进行鉴定。本研究采用真菌rDNA-ITS区和TEF-1α区的通用引物对供试菌株DNA进行PCR扩增。结果表明，ITS对亲缘性相近的物种分辨率不够高，而采用TEF-1α序列分析可以确定镰刀菌的“种”级关系。另外，从系统发育树可以看出，同种镰刀菌同源性很高，不同种间同源性较低，进一步说明了镰刀菌种间遗传分化水平高的特点。

生物学特性研究表明，供试F.incarnatum在10～30℃均可生长，20～30℃下生长较快；最适生长、产孢pH分别为8和7。该特性与甜瓜果腐病的相同病原菌报道[18]相似。与甜瓜果腐病菌[18]相比，本研究供试菌株生长速率更快，但产孢量和致死温度较低。另外，全光照处理有利于供试F.incarnatum生长，不利于其产孢；但王燕等[18]报道的甜瓜果腐病菌F.incarnatum在不同光照处理下生长和产孢无显著性差异。以上结果说明F.incarnatum不同菌株间存在明显的生物学特性差异，这可能与寄主有关。F.proliferatum在10～35℃均可生长，20～30℃下生长较快；在pH 7～10下生长无显著性差异；最适生长、产孢pH分别为8和7；在不同光照条件下，其生长无显著性差异，这与王明道等[20]报道的层出镰刀菌的生物学特性基本相同。另外，PSA和PDA培养基有利于2种镰刀菌的生长和产孢；通过SNA和VBC培养基可诱导大孢子的产生，以便观察到更典型的孢子形态，即大型分生孢子隔膜更加清晰，顶部和基部更易区分，足细胞更加明显。

4 结论

对南北疆病样进行组织分离、单孢纯化，根据形态学鉴定、分子生物学鉴定以及致病性测定将引起新疆棉花茎腐病的病原确定为变红镰刀菌（F.incarnatum）和层出镰刀菌 （F.proliferatum）。不同条件的培养试验结果表明：这2种病原菌最适生长和产孢温度均为25℃；光照有利于F.incarnatum生长，但不利于其产孢，而F.proliferatum在不同光照条件下菌落生长无显著性差异；黑暗培养有利于二者产孢；二者生长的最适pH均为8，产孢的最适pH均为7；F.incarnatum和F.proliferatum孢子的致死温度分别为48℃、60℃，菌丝的致死温度分别为50℃、61℃；PSA和PDA培养基有利于二者生长和产孢，而VBC和SNA培养基适用于二者形态学观察。