薄维波，李海英，安仲武，冯小娟，王 波，闫朝春△，朱洪波，郭加友

南京医科大学康达学院附属连云港市东方医院:1.检验科；2.普外科；3.肿瘤科，江苏连云港 222042

肝细胞癌(HCC)是最常见的恶性肿瘤，在世界范围内，其发病率和病死率居恶性肿瘤前列[1]，早期HCC患者无明显的症状，发现时大多数已处于中晚期，病死率较高。因此，HCC的早期诊断、早治疗，对患者的预后有很大帮助。LIEBMAN等[2]学者于1984年首次报道，约90%的HCC患者血清异常凝血酶原复合物即维生素K缺乏或拮抗剂Ⅱ诱导的蛋白(PIVKA-Ⅱ)水平明显升高。细胞质胸苷激酶1(TK1)是近年发现的新型肿瘤标志物，其血清水平的高低与肿瘤细胞增殖速度呈正比例关系，是影响HCC患者预后的一项独立危险因素[3]。本研究旨在探讨单独及联合检测PIVKA-Ⅱ、TK1和甲胎蛋白(AFP)对HCC患者的诊断价值，报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年1月至2019年12月在本院诊治的HCC患者61例、肝硬化(LC)患者50例、慢性肝炎(CH)患者58例及体检健康者60例作为研究对象，分别作为HCC组、LC组、CH组及对照组。HCC组患者中男38例、女23例，年龄36～65岁、平均(52.4±7.1)岁，并按国际抗癌联盟/美国癌症联合会(UICC/AJCC)2010年的TNM分期标准[4]分为Ⅰ～Ⅱ期53例、Ⅲ～Ⅳ期8例；LC组患者中男35例、女15例，年龄36～75岁、平均(57.3±7.5)岁；CH组患者中男38例、女20例，年龄31～75岁、平均(49.3±5.8)岁；对照组中男33例、女27例，年龄26～58岁、平均(42.4±5.8)岁。HCC、LC、HC的诊断分别符合《原发性肝癌诊疗规范(2017年版)》和《病毒性肝炎防治方案》中的诊断标准[5-6]。4组研究对象年龄、性别比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会审核批准后实施，所有研究对象均签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1标本采集与保存 抽取各研究对象清晨空腹静脉血5 mL，静置30 min，4 000 r/min离心15 min，分离血清，置于-25 ℃冰箱保存备用。

1.2.2检测方法 采用美国贝克曼公司Dxl 800 Access化学发光免疫分析仪及其配套的试剂盒检测血清PIVKA-Ⅱ和AFP水平；采用深圳华瑞同康有限公司CIS-1型化学发光数字成像分析仪及TK1细胞周期分析试剂盒检测血清TK1水平。以上均严格按仪器及试剂盒说明书进行操作操作。正常参考范围：PIVKA-Ⅱ<40 mAU/mL，TK1<2.0 pmol/L，AFP<10.0 ng/mL，高于正常参考值范围为阳性。

2 结 果

2.1HCC组与良性肝病组患者一般资料比较 HCC组与良性肝病组患者(包括LC组、CH组患者)的年龄、性别、病原学资料、肝功能分级(Child-pugh分级)比较，差异无统计学意义(P>0.05)。83.6%的HCC患者为乙型肝炎病毒(HBV)感染，62.3%的患者肝功能分级为Child-pugh B或C级。见表1。

表1 一般资料在HCC组与良性肝病组患者间的比较

2.2各组血清PIVKA-Ⅱ、TK1和AFP水平比较 经K-S检验各组数据均为非正态分布，故采用H检验进行组间比较，结果显示，HCC组、LC组、CH组及对照组血清PIVKA-Ⅱ、TK1和AFP水平比较，差异均有统计学意义(H=65.30、55.47、38.69，P<0.05)。采用U检验进行两两比较，结果显示，HCC组血清PIVKA-Ⅱ水平高于LC组、CH组和对照组，差异均有统计学意义(u=1 368.47、544.62、1 687.21，P<0.05)；LC组、CH组血清PIVKA-Ⅱ水平与对照组比较，差异无统计学意义(u=685.32、478.35，P>0.05)。HCC组血清TK1水平高于LC组、CH组和对照组，差异均有统计学意义(u=221.56、248.63、542.11，P<0.05)；LC组、CH组血清TK1水平高于对照组，差异均有统计学意义(u=1 683.41、659.23，P<0.05)；LC组和CH组血清TK1水平比较，差异无统计学意义(u=1 067.23，P>0.05)。HCC组血清AFP水平高于LC组、CH组及对照组，差异均有统计学意义(u=425.36、1 652.31、488.25，P<0.05)；LC组、CH组血清AFP水平高于对照组，差异均有统计学意义(u=1 425.47、887.36，P<0.05)；LC组和CH组血清AFP水平比较，差异无统计学意义(u=1 678.36，P>0.05)。在HCC组中，血清PIVKA-Ⅱ、TK1水平随着病理分期严重程度的增加而逐渐升高，Ⅰ～Ⅳ期血清PIVKA-Ⅱ、TK1水平比较，差异均有统计学意义(H=24.38、31.21，P<0.05)。见表2。

表2 各组血清PIVKA-Ⅱ、TK1和AFP水平比较[M(P25,P75)]

2.3PIVKA-Ⅱ、TK1和AFP单项及联合检测对HCC的诊断效能 单独检测诊断HCC时，PIVKA-Ⅱ的灵敏度(86.89%)和TK1的特异度(86.62%)最高；2项联合检测诊断HCC时，AFP/TK1并联检测(其中一项阳性即为阳性)的灵敏度(91.80%)和AFP+PIVKA-Ⅱ串联检测(2项均阳性才为阳性)的特异度(95.88%)最高；3项联合检测诊断HCC时，AFP/TK1/PIVKA-Ⅱ并联检测(其中一项阳性即为阳性)的灵敏度(95.08%)和AFP+TK1+PIVKA-Ⅱ串联检测(3项均阳性才为阳性)的特异度(96.29%)较高。PIVKA-Ⅱ、TK1、AFP单独检测诊断HCC的最佳临界值分别为35.88 mAU/mL、2.15 pmol/L和11.70 ng/mL，3项联合检测诊断HCC的AUC[0.928(95%CI：0.799～0.952)]高于单独检测诊断HCC的AUC[0.839(95%CI：0.753～0.886)、0.801(95%CI：0.720～0.843)、0.708(95%CI：0.549～0.740)]，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3～5、图1。

表3 PIVKA-Ⅱ、TK1和AFP单独及联合检测对HCC的诊断效能

表4 PIVKA-Ⅱ、TK1和AFP联合检测诊断HCC的Logistic回归分析拟合参数

表5 PIVKA-Ⅱ、TK1和AFP单项检测及三项联合检测诊断HCC的AUC及相关参数

注：A、B、C、D分别为AFP、TK1、PIVKA-Ⅱ单独检测及三项联合检测诊断HCC的ROC曲线。

2.4PIVKA-Ⅱ、TK1在AFP阴性的HCC患者中的检测意义 在26例AFP阴性的HCC患者中，PIVKA-Ⅱ阳性21例，灵敏度为80.77%；TK1阳性15例，灵敏度为57.69%；PIVKA-Ⅱ和TK1联合检测阳性24例，灵敏度为92.31%。PIVKA-Ⅱ和TK1联合检测的灵敏度高于单独检测，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨 论

HCC是我国最常见的恶性肿瘤，其病死率在恶性肿瘤中居于第2位，早期诊断HCC是治疗和延长患者生存期的关键。迄今为止，AFP是临床上使用最广泛的HCC血清学标志物，但是其诊断的灵敏度及特异度均较低，约有30%的HCC患者AFP呈阴性[7]，存在一定的漏诊率，而与其他肿瘤标志物联合检测可能会增加HCC的确诊率[8]。

PIVKA-Ⅱ被认为是一种新型的肿瘤标志物，在日本和欧美一些发达国家，有研究表明PIVKA-Ⅱ对于HCC的诊断效能明显高于AFP，其作为HCC常规筛查手段在临床已经得到广泛应用[9]，现已将PIVKA-Ⅱ作为诊断HCC的一项重要指标。

TK1于19世纪60年代被发现在增殖细胞中表达[9]。癌症患者血清中TK1水平和活性升高，而健康人较低或检测不出。有研究表明，TK1可以适用于恶性肿瘤的细胞增殖度检测，对肿瘤细胞增殖活性的检测、疗效监测和预后评估具有重要的临床意义[10-11]。

我国作为肝癌大国，每年肝癌的发病率约占全世界的一半以上，其中90%的病因为HBV感染，与日本和欧美的以HCV感染和酒精性肝病为主要病因学组成有明显区别。本研究显示，PIVKA-Ⅱ水平在HCC患者血清中升高，HCC组与LC组、CH组、对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，证实血清PIVKA-Ⅱ是诊断HCC的一个较好指标。当发生HCC时，患者体内癌细胞合成凝血酶原前体发生异常，凝血酶原前体羧化缺乏，导致PIVKA-Ⅱ的生成量增加，使血清中PIVKA-Ⅱ水平明显升高。此外，本研究还显示，LC组和CH组的血清PIVKA-Ⅱ水平与对照组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，而LC组和CH组的血清TK1和AFP水平均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，结果表明PIVKA-Ⅱ不易受CH、LC等非HCC因素的影响，而AFP和TK1诊断HCC容易受到非HCC因素的影响，提示PIVKA-Ⅱ比TK1能更好地区分良恶性肝病，可作为HCC早期筛查的重要肿瘤标志物，此研究结果与LIM等[12]、罗丽丹等[13]的研究报道一致。

血清肿瘤标志物单项检测诊断HCC的灵敏度和(或)特异度欠佳，为减少漏诊、误诊，可采用血清肿瘤标志物多项联合检测诊断HCC。单项指标检测诊断HCC时，PIVKA-Ⅱ的灵敏度(86.89%)最高，但TK1的特异度(86.62%)最高；两项检测方案中，AFP/TK1并联检测的灵敏度(91.80%)最高，而AFP+PIVKA-Ⅱ串联检测的特异度(95.88%)最高；3项检测方案中，AFP/TK1/PIVKA-Ⅱ并联检测的灵敏度(95.08%)较高，而AFP+TK1+PIVKA-Ⅱ串联检测的特异度(96.29%)更高。PIVKA-Ⅱ、TK1和AFP联合检测诊断HCC的AUC为0.928，高于各指标单独检测(P<0.05)，且灵敏度和特异度也较各指标单独检测高，进一步验证了联合检测可明显提高HCC的诊断效能，对HCC高危人群的筛查及早期诊断有重要的临床参考价值。另外，通过ROC曲线得出PIVKA-Ⅱ、TK1和AFP诊断HCC的最佳临界值分别为35.88 mAU/mL、2.15 pmol/L和11.70 ng/mL；其中PIVKA-Ⅱ的最佳临界值比文献[14-15]报道的40 mAU/mL略低，其原因可能为纳入的HCC患者主要为术前或行介入治疗的早中期患者(Ⅰ～Ⅱ期53例，占86.89%)，晚期患者纳入不足(Ⅲ～Ⅳ期8例，仅占13.11%)，导致HCC组PIVKA-Ⅱ平均水平有所降低，使最佳临界值略低于文献报道。另外，值得一提的是，本研究26例AFP阴性的HCC患者中有21例PIVKA-Ⅱ阳性，灵敏度达到80.77%，与林莺莺等[16]报道观点相近，PIVKA-Ⅱ在AFP阴性的HCC患者中有较高的灵敏度，提示血清PIVKA-Ⅱ在诊断AFP阴性的HCC时也存在一定的优势。此外，PIVKA-Ⅱ和TK1串联检测可提升特异度，说明PIVKA-Ⅱ和TK1串联检测能有效地避免部分AFP阴性HCC病例的漏检，该研究结论亦少见相关文献报道。

综上所述，PIVKA-Ⅱ、TK1和AFP联合检测可提高诊断HCC的灵敏度，PIVKA-Ⅱ和TK1检测对AFP阴性的HCC患者具有互补性，对HCC的早期诊断具有重要的应用价值。本研究作为回顾性研究，样本量较小，纳入的病例代表性有限，可能存在选择偏倚、信息偏倚等局限性，仍需进行大样本量的前瞻性、多中心研究进一步证实本研究所得结论。