尹 剑,徐 睿,阿热爱·巴合提,李平兰,武瑞赟

(1.中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083; 2.北京水产技术推广站,北京 100176; 3.新疆维吾尔自治区产品质量监督检验研究院,新疆乌鲁木齐 830013)

随着人们生活水平的提高,II型糖尿病(Type 2 diabetes,T2DM)的发病率逐年增加[1-2],患者身体健康问题越来越严重,经济负担越来越重。II型糖尿病又称为非胰岛素依赖型糖尿病,体内的胰岛细胞破坏并不严重,仍然能够产生一定量的胰岛素,但机体对胰岛素产生抵抗,从而导致胰岛素出现相对不足[3]。目前,Ⅱ型糖尿病常用的治疗药物中二肽基肽酶-IV(Dipeptidyl peptidase IV,DPP-IV)抑制剂可以促进胰岛β细胞释放胰岛素,抑制胰岛α细胞分泌胰高血糖素,降低血糖,且不易诱发低血糖和增加体重,因此二肽基肽酶-IV(Dipeptidyl peptidase IV,DPP-IV)抑制剂的开发受到广泛的关注[4-6]。常见的DPP-IV化学合成抑制剂如西格列汀(sitagliptin)、维格列汀(vildagliptin)等可能存在副作用,如引起低血糖、上呼吸道感染、腹泻等症状[7-8]。目前研究主要集中在具有DPP-IV抑制活性的高效、低副作用的食源性活性肽的分离提纯,如牛奶中的乳蛋白肽具有α-葡萄糖苷酶和DPP-IV抑制特性[9],黑豆通过其水解获得的肽级分(HPI)可以抑制DPP-IV活性[10],Sila等[11]从海蛾鱼中分离出具有DPP-IV抑制活性的多肽Trp-Ser-Gly和Phe-Ser-Asp。

但是DPP-IV抑制肽的食用形式、保存形式研究报道较少,其他类降血糖药物如胰岛素等,常见的保存形式是复方制剂,温度是2～8 ℃,温度过高或过低都会导致胰岛素失效,给该类药物的携带和保存带来不便[12-13]。咀嚼片由于便于携带,可直接咀嚼吞服,功效成分溶出速度快、生物利用率高,且可以制作成不同的形状,近年来常作为功能性食品制作形态[14],广泛应用于食品、药品产品[15-16]。开发一种具有稳定活性的固体形态咀嚼片对DPP-IV抑制肽的应用具有重要作用。

实验室前期通过酶解制备出活性较好且具有DPP-IV抑制活性的鲟鱼皮DPP-IV抑制肽粉。本研究拟采用单因素实验及响应面试验法在增大肽粉用量的基础上得到最优咀嚼片配方,之后以片剂的硬度、片重差异及脆碎度的综合评价值为指标优化咀嚼片压片工艺条件,制备出具有降血糖活性的鲟鱼皮DPP-IV抑制肽咀嚼片,以期为咀嚼片的研发制备提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鲟鱼皮胶原蛋白肽 实验室前期制备(鲟鱼为史氏鲟);木糖醇、硬脂酸镁、羧甲基纤维素钠、微晶纤维素 苏州益景食品添加剂有限公司;脱脂奶粉 内蒙古伊利实业集团股份有限公司;DPP-IV抑制剂筛选试剂盒、Folin-酚乙液 Sigma,USA。

FD-27S冷冻干燥机 北京德天佑科技发展有限公司;FiveEasy系列pH计 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;标准筛 河北航旭不锈钢丝网有限公司;GZX-9023MBE电热恒温鼓风干燥箱 上海博讯实业有限公司;DSY-9002研磨机 永康市九顺莹商贸有限公司;AUW-D电子分析天平 日本岛津公司;YEJ2旋转式压片机 上海力超电机有限公司;YD-2脆碎度测试仪 天津市光学仪器厂;JJG-139硬度仪 中航长城计量测试(天津)有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 制备胶原蛋白肽 将鲟鱼皮洗净除杂,切成小块后用浓度为0.4%的盐酸浸泡2 h,蒸馏水将鱼皮冲洗至弱酸性后高压浸提(121 ℃,2 h),过滤掉鱼皮后用抽滤除掉油脂等杂质,得到明胶液后冷冻干燥成干粉,之后溶解后木瓜蛋白酶酶解(加酶量10170.35 U/g,pH6.12,酶解温度50 ℃,酶解时间12.12 h,料液比1%),将酶解液冻干得到胶原蛋白肽。

1.2.2 咀嚼片制备工艺 将主料鲟鱼皮胶原蛋白肽与辅料微晶纤维素、木糖醇、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、奶粉等分别各自研磨粉碎,过80目标准筛后加水(总的原辅料和水的质量比约为10∶1)充分混匀,使物料达到“握之成团,触之即散”的状态,将物料挤压通过20目标准筛,在55 ℃下恒温干燥至水分失重(物料在90 ℃条件下干燥10 min失去水分占物料总质量比重)达到1%～3%为止,此时混合粉的水分含量为3%～5%;再次使用20目标准筛筛分[17],筛下物中加入润滑剂硬脂酸镁,混合均匀后用旋转压片机制得咀嚼片。

1.2.3 鲟鱼皮DPP-IV抑制肽咀嚼片配方优选

1.2.3.1 咀嚼片配方单因素实验 分别探究肽粉、木糖醇、羧甲基纤维素钠、硬脂酸镁不同添加量对感官评分的影响,感官评价采用模糊数学法进行分析,设定对产品的色泽、硬度、形态、口感、口味5个因素进行感官分析,将产品的等级分为优、良、中、差4个等级,确定四种物质的最佳添加量。

物料中木糖醇添加量为10%,羧甲基纤维素钠添加量为10%,奶粉及硬脂酸镁添加量分别是5%、5%,各组分别添加30%、40%、50%、60%、70%的肽粉,剩余物料由微晶纤维素填充。按照上述工艺制备肽粉咀嚼片,并进行感官评定,确定最优肽粉添加量。

在各种原料添加量分别为肽粉50%、硬脂酸镁5%、羧甲基纤维素钠10%、奶粉10%的条件下,添加不同量的木糖醇(5%、10%、15%、20%、25%),其余为微晶纤维素。按照上述工艺制备肽粉咀嚼片,并进行感官评定,确定最优甜味剂添加量。

在各原料添加量分别为肽粉50%、木糖醇10%、硬脂酸镁5%、奶粉10%的条件下,设计五种不同水平的羧甲基纤维素钠添加量(3%、5%、7%、9%、11%),其余为微晶纤维素。按照上述工艺制备肽粉咀嚼片,并进行感官评定,确定最优粘合剂添加量。

在各原料添加量分别为肽粉50%、木糖醇10%、CMC-Na 15%、奶粉10%的条件下,添加不同量的硬脂酸镁(3%、5%、7%、9%、11%),其余为填充剂微晶纤维素。按照上述工艺制备肽粉咀嚼片,并进行感官评定,确定最优硬脂酸镁添加量。

1.2.3.2 咀嚼片配方响应面试验 根据单因素实验结果,采用Box-Behnken(BBD)法,利用Design-Expert 8.0.6软件进行响应曲面分析,实验因素水平如表1所示。实验模型对感官评分进行二次多元回归拟合,得到等高线图及响应曲面图,获得咀嚼片最优配方,对模型进行方差分析,确定可信度,对预测结果进行进一步验证。

表1 Box-Behnken试验设计因素水平表Table 1 Factors and levelsTable of Box-Behnken experimental design

1.2.4 鲟鱼皮DPP-IV抑制肽咀嚼片制备工艺优化

1.2.4.1 咀嚼片工艺优化单因素实验 采用优化得到的最优配方,选择充填压力、充填深度、转台速度和原料粒度为咀嚼片工艺条件优化试验的单因素,以片重差异、硬度及脆碎度的综合评定值为指标确定各因素的最优值。

取粒度为80目的原料肽粉,设置充填压力24 kN、充填深度14 mm、原料粒度100目,分别将原料在转台速度15、20、25、30、35、40 r/min条件下压片成型。研究转台速度对产品综合评定值的影响。

设置充填压力24 kN、转台速度25 r/min、原料粒度100目,分别将原料在充填深度5、8、11、14、17 mm条件下压片成型。研究原辅料的充填深度对产品综合评定值的影响。

设置充填深度11 mm、转台速度25 r·min-1、原料粒度100目,分别将原料在压力12、16、20、24、28 kN下压片成型。研究不同充填压力对产品综合评定值的影响。

设置充填深度11 mm、转台速度25 r·min-1、充填压力24 kN,分别将原料粒度控制在150、200、250、300、350目下压片成型。研究不同原料粒度对产品综合评定值的影响。

1.2.4.2 咀嚼片工艺优化正交试验 在单因素实验的基础上,以充填压力、充填深度、转台速度和原料粒度为因素,以综合评定值为指标,设计4因素3水平L9(34)正交试验,各因素水平如表2所示,用IBM SPSS Statistics. V20设计正交试验并进行方差分析,确定咀嚼片制备工艺最佳条件。

表2 咀嚼片制备工艺正交试验因素水平表Table 2 Levels and factorsTable of orthogonal experimental for preparation of chewableTablets

1.2.5 咀嚼片的感官评定

1.2.5.1 产品质量标准 采用模糊数学法对产品的色泽、硬度、形态、口感、口味5个因素进行感官分析[18],将产品的等级分为优、良、中、差4个等级,感官评定指标如表3所示,共10人参与感官评定。

表3 咀嚼片感官评定标准Table 3 Sensory evaluation criteria for chewableTablets

1.2.5.2 建立模糊矩阵 参考钱俊等[19]的计算方法,品评因素集、评价等级集、权重集的确定:U={U1,U2,U3,U4,U5},其中品评因素集U指咀嚼片感官评价构成因素的集合,U1,U2,U3,U4,U5分别对应色泽、硬度、形态、口感、口味。评价等级集V指对每个因素的评价结果,V={V1,V2,V3,V4,V5},V中每个值都对应四种打分等级:优(100分)、良(75分)、中(50分)、差(25分),用模糊矩阵R来表示U×V的模糊关系。依据咀嚼片感官指标内容和评价结果,将色泽、硬度、形态、口感、口味的权重集确定为X={0.1,0.3,0.1,0.2,0.3}。模糊关系综合评判集:Y=X×R,Y为需要评价的产品的集合。

1.2.6 咀嚼片各项指标的测定

1.2.6.1 咀嚼片片重差异的测定 取咀嚼片分别测定质量,计算平均片重,比较每片咀嚼片重量与平均片重的差异。不得有多于2片超出重量差异限度,并且不得有1片超出重量差异限度1倍[20-21]。平均片重大于等于0.3 g的样品中重量差异限度为±5.0%,平均片重小于0.3 g的样品中重量差异限度为±7.5%。

1.2.6.2 咀嚼片硬度的测定 依据中华人民共和国药典2010年版的标准[22]测定。

1.2.6.3 咀嚼片脆碎度的测定 依据中华人民共和国药典2010年版的标准[22]测定。

1.2.6.4 咀嚼片综合评定值分析 取片重差异(α1)、硬度(α2)及脆碎度(α3)评分值之和为综合评定值。由于硬度指标有利于咀嚼片成型,取硬度数值的0.1倍作为评定值;由于片重差异及脆碎度两个指标不利于咀嚼片成型,均取二者数值倒数的10倍作为评定值,综合评定值越高表示咀嚼片成型性越好,片重不足时记为0。

1.2.7 咀嚼片DPP-IV抑制活性的测定 将咀嚼片按一定浓度(20 mg/mL)溶解,用DPP-IV抑制剂筛选试剂盒测定溶液DPP-IV抑制活性。

1.3 数据处理

试验数据以平均值±标准差的形式表示。利用SPSS软件(20.0版本)进行单因素方差分析,并且通过Duncan检验来评价不同组平均值之间的差异显著性,显著水平为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 鲟鱼皮DPP-IV抑制肽咀嚼片配方优选

2.1.1 咀嚼片配方单因素实验

2.1.1.1 肽粉添加量的确定 根据肽粉添加量对咀嚼片品质影响的单因素试验结果建立模糊矩阵,矩阵中的rij表示咀嚼片的各项评价指标在该指标评价结果中的隶属程度。

根据模糊变换原理,用矩阵乘法计算咀嚼片对各类因素的隶属度Y=X×R,咀嚼片感官质量综合评价结果向量计算如下:

H1=0.13×100+0.06×75+0.83×50+0.18×25=53.50;

H2=0.1×100+0.06×75+0.75×50+0.09×25=54.25;

H3=0.23×100+0.25×75+0.4×50+0.12×25=64.75;

H4=0.12×100+0.19×75+0.64×50+0.05×25=59.50;

H5=0.1×100+0.21×75+0.55×50+0.14×25=56.75。

由综合得分可知,第三组即对应肽粉添加量为50%时,咀嚼片的综合得分最高。

2.1.1.2 木糖醇添加量的确定 木糖醇添加量试验结果向量如下:

Y1=(0.10,0.22,0.56,0.12);Y2=(0.12,0.23,0.62,0.03);Y3=(0.15,0.23,0.59,0.03);Y4=(0.21,0.49,0.30,0);Y5=(0.23,0.32,0.42,0.03)。

各组实验综合得分为:H1=57.50;H2=61.00;H3=62.50;H4=72.75;H5=68.75。

由综合得分可知,第四组即木糖醇添加量为20%,咀嚼片综合得分最高。

2.1.1.3 CMC-Na添加量的确定 对CMC-Na添加量分别为3%、5%、7%、9%、11%的咀嚼片进行感官评价,咀嚼片感官质量综合评价的结果向量如下:

Y1=(0.06,0.52,0.36,0.06);Y2=(0.10,0.55,0.29,0.06);Y3=(0.20,0.56,0.21,0.03);Y4=(0.10,0.53,0.34,0.03);Y5=(0.17,0.38,0.45,0)。

各组实验综合得分为:H1=64.50;H2=67.25;H3=73.25;H4=67.50;H5=68.00。

由综合得分可知,第三组即对应CMC-Na添加量为7%时咀嚼片综合得分最高。

2.1.1.4 硬脂酸镁添加量的确定 添加不同质量分数的硬脂酸镁进行感官评价,结果向量为:

Y1=(0.35,0.46,0.11,0.08);Y2=(0.26,0.57,0.17,0);Y3=(0.40,0.50,0.10,0);Y4=(0.37,0.46,0.17,0);Y5=(0.3,0.5,0.2,0)。

各组实验综合得分为:H1=77.00;H2=77.25;H3=82.50;H4=80.00;H5=77.50。

由综合得分可知,第三组即硬脂酸镁添加量为7% 时咀嚼片综合得分最高。

2.1.2 咀嚼片配方响应面试验 根据单因素实验的结果,设计4因素3水平的Box-Behnken试验,试验设计如表1所示。

依据试验因素设计表,通过Design Expert 8.0.6软件设计29组试验,以感官评分为响应值,实验方案及结果如表4所示:

表4 Box-Behnken试验设计及结果Table 4 The design and results of Box-Behnken experiment

表5 Box-Behnken试验回归模型方差分析Table 5 The AVOVA of Box-Behnken experiment

表6 Box-Behnken试验回归模型的可信度分析Table 6 Reliability analysis of regression model of Box-Behnken test

根据Box-Behnken试验结果,建立回归模型并进行方差分析,结果如表5所示。

由表5可得模型的P<0.0001,表明模型回归极显著。模型失拟项P值为0.8127>0.05,失拟检验不显著,表明未知因素对实验结果干扰较小。模型R2=0.9064,表明该模型拟合较好。由表6可知模型信噪比为13.241,大于4.0,表明上述模型合理、可用。以上分析结果表明模型选择适当。

利用Design Expert 软件对上述实验模型进行二次多元回归拟合处理,取得感官综合得分(Y)对肽粉添加量(A)、木糖醇添加量(B)、CMC-Na添加量(C)、硬脂酸镁添加量(D)的二次多元回归方程为:

图1 两因素交互作用的响应面图和等高线图Fig.1 Response surfaces and the contour plots of two factors

Y=59.87-1.82A-0.56B-1.43C-1.55D-1.14AB+0.12AC-1.26AD-1.62BC-1.44BD-1.25CD+0.76A2-2.70B2-0.062C2-1.19D2

根据上述二次多元回归拟合方程及回归模型方差分析表得到二次回归方程响应面3D图如图1所示,图中可展示出各因素交互作用对感官综合评分的影响,响应面坡度越陡峭表明感官综合评分对于配方的改变越敏感,该因素对感官综合评分的影响越大。在交叉项对感官综合评分的影响中,各因素之间交互作用不明显。根据回归方程预测感官综合得分最高的方案为肽粉添加量46.52%,木糖醇添加量23.94%,CMC-Na添加量7.88%,硬脂酸镁添加量7.00%,奶粉添加量10%,微晶纤维素添加量4.66%,此条件下预测的感官评价综合得分为70.3147分。依照此配方压片,片剂感官评价综合得分为69.75分,与模型预测值无显著性差异(P>0.05)。

2.2 鲟鱼皮DPP-IV抑制肽咀嚼片制备工艺优化

2.2.1 咀嚼片制备工艺优化单因素实验 采用控制变量的方法,探究不同因素对产品综合评定值的影响,以期为正交试验的设计提供依据。试验结果见图2。

由图2可知,随着转台速度(图2A)、填充深度(图2B)、填充压力(图2C)、原料粒度(图2D)的增加,产品综合评定值都呈先增加后下降的趋势,其中,转台速度在15～25 r/min时,综合评定值为4.42～7.87,转台速度继续增长时由于转台速度太快导致压片时出现粘冲现象,产品表面不光滑,综合评定值降低(图2A);图2B显示,将填充深度控制在5～17 mm之间,产品综合评定结果显示在11 mm达到最大为5.76±0.74;在固定转台速度和填充深度的情况下,图2C显示,填充压力为24 kN时综合评价值最大,填充压力大于24 kN时评价值随着充填压力增长逐渐降低;固定以上因素,由图2D可知,在原料粒度为300目时产品综合评定值达到最大,之后随着原料粒度目数增加产品综合评定值下降。出现这种情况的原因可能是产品粒度过小导致粘结性降低,影响产品成型效果,综合评定值降低。

2.2.2 咀嚼片制备工艺优化正交试验 在单因素实验结果的基础上,选择转台速度、充填深度、充填压力及原料粒度四个因素设计正交实验,各因素水平如表2所示。

图2 转台速度(A)、充填深度(B)、充填压力(C)、原料粒度(D)对产品综合评定值的影响Fig.2 Effects of turntable speed(A),filling depth(B),filling pressure(C), raw material granularity(D)on comprehensive assessment value of products

表7 正交实验方案及结果Table 7 Design and results of orthogonal tests

正交试验结果如表7所示,在本试验正交范围内,转台速度、充填深度、充填压力及原料粒度4个因素的综合评价值均值间存在显著性差异(P<0.05)。结果表明,制备鲟鱼皮DPP-IV抑制肽咀嚼片的最优工艺条件为A1B2C3D3,即转台速度20 r/min,充填深度11 mm,充填压力28 kN,原料粒度350目。各因素对咀嚼片综合评价值的影响顺序为:A>C>D>B。

由表8可知,转台速度、充填压力及原料粒度对咀嚼片制备工艺影响极显著(P<0.01),但充填深度对咀嚼片制备工艺无显著性影响。

表8 正交试验结果方差分析Table 8 Analysis of variance for orthogonal tests

本试验基于咀嚼片配方的优化,探究了充填压力、充填深度、转台速度及原料粒度等工艺参数对鲟鱼皮DPP-IV抑制肽咀嚼片综合品质的影响。研究结果分别与前人的以下研究结果相似。

转台速度对产品质量影响最大,这与高志江[23]的研究结果一致,对产品硬度影响效果大小的因素依次为转台速度、颗粒水分、搅拌时间和润湿剂用量。转台速度太快会导致片剂表面细粉在压片时被冲模和冲头黏附,导致片剂表面凹凸不平,转台速度过小会影响生产效率,使生产成本增高。

充填压力对产品质量影响较大,咀嚼片压片过程中充填压力越大物料之间结合力越强,当压力超过物料弹性限度后产生塑性变形,增大物料粒子的接触面积,增大结合力进而使物料成型。在一定范围内物料结合力越大则片剂硬度越大,脆碎度越小,综合评定值越高,该结果与李然等[24]研究结果相同。

原料粒度对鲟鱼皮DPP-IV抑制肽咀嚼片质量的影响也较大,原料粒度越小,孔隙率和比表面积越大,综合评价值随之升高,这与Kaerger等[25]的研究结果一致;充填深度对产品质量影响较小。

2.2.3 验证试验 依据正交试验得出的最优咀嚼片制备工艺制得一批咀嚼片,并进行产品综合评定值检测,得到的综合评价值为10.21±0.53,显著高于正交试验中各组试验结果(P<0.05),表明转台速度20 r/min,充填深度11 mm,充填压力28 kN,原料粒度350目是最优咀嚼片制备工艺。

2.3 咀嚼片DPP-IV抑制活性验证

利用优化后的压片工艺制备一批咀嚼片,按一定浓度(20 mg/mL)将咀嚼片溶解后测得DPP-IV抑制率为80.88%±0.45%。针对降血糖活性咀嚼片的研究较少,主要集中在以天然产物为基础原料开发降血糖咀嚼片。本研究利用酶解鲟鱼皮所制得的胶原蛋白肽为原料,制备出具有抑制DPP-IV活性的咀嚼片。目前国内外在DPP-IV抑制剂这种Ⅱ型糖尿病治疗药物方面的研究甚多[4-6],而此种以食源性活性肽为原料制备可降血糖的DPP-IV抑制肽咀嚼片的研究前人少有涉及。

3 结论与讨论

本研究通过单因素实验和响应面法,以感官评分为指标并利用模糊数学法进行分析确定最佳的配方工艺,进一步以片剂的硬度、片重差异以及脆碎度的综合评定值为指标,利用单因素和正交试验的方法,对鲟鱼皮DPP-IV抑制肽咀嚼片的制备工艺进行了优化。实验结果显示,咀嚼片的最优配方为肽粉添加量46.52%,木糖醇添加量23.94%,CMC-Na添加量7.88%,硬脂酸镁添加量7.00%,奶粉及微晶纤维素添加量为10%与4.66%。咀嚼片制备工艺条件为转台速度20 r/min,充填深度11 mm,充填压力28 kN,原料粒度350 目时,咀嚼片整体较好,综合评价值最高,在此条件下制得的咀嚼片20 mg/mL 浓度下DPP-IV抑制率可达80.88%±0.45%。片剂作为口服食品、药品的常见形式,其湿法造粒工艺中的配料配比及压片工艺等方面研究较为成熟。但是,不同的物质具有不用的生产加工特性,对于含有DPP-IV抑制肽的加工工艺的研究较少,尤其是含有鲟鱼鱼皮提取的DPP-IV抑制肽的咀嚼片的研究报道更为少见。在配料配比方面,已有多篇报道对咀嚼片的配方进行研究[26],本研究的配方与夏志楷等[27]的成分相似,添加了具有一定保健功能的木糖醇,但是由于本身原料肽粉与荸荠皮纤维基料性质的差异,因此具体成分配比有差异。本研究不仅可为DPP-IV抑制肽咀嚼片的研发提供参考,而且为开发具有DPP-IV抑制活性的降血糖食品扩展了新思路。