曹少谦,孙 程,秦伟力,褚盈雁,李冲冲,王正东,戚向阳,*,杨 华

(1.浙江万里学院生物与环境学院,浙江宁波 315100; 2.宁波市农产品加工技术重点实验室,浙江宁波 315100; 3.宁波裕天海洋生物科技有限公司,浙江宁波 315100)

我国每年约400万吨的低值杂鱼,且随着海洋经济鱼类资源的衰退,低值鱼捕捞量呈上升趋势,约占海域捕捞总量的57%～59%。这些低值鱼用于食品加工的仅占30%左右,导致资源浪费。鱼粉生产一直是开发利用低值鱼蛋白的主要手段,但是我国的鱼粉加工产业加工技术不完善,不仅鱼粉品质普遍较差,而且环境污染较为严重[1-2]。鱼粉加工过程中会产生大量废弃压榨液,每生产1吨鱼粉,大约产生2～3吨压榨液,而压榨液的化学耗氧量和生物耗氧量高,直接排放会产生严重污染[3-4]。压榨液中含有蛋白质、脂肪、微量元素等多种营养成分,具有应用潜力[5-7]。其中鱼油含量随季节、鱼品种而发生变化,一般在1.5%～15%,具有开发利用价值[8]。目前,全世界食用鱼油产量约30万吨左右,而我国海洋鱼油年产量约3万吨,且近年来我国生产鱼油的金枪鱼等原料遭过度捕捞,资源严重下降[9],因此,对鱼粉加工压榨液中脂肪的开发利用,不仅可弥补鱼油产原料的不足,还可提高鱼粉加工副产物的综合利用率。

海洋鱼油的加工利用一直是国内外研究的热点,也是低值鱼高值化利用的主要途径之一。海洋鱼油的多不饱和脂肪酸以ω-3系列多不饱和脂肪酸中的二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)最为重要,具有减少胆固醇含量、抗动脉硬化、预防阿尔兹海默症、提升大脑机能和防止视力减退等多种生理功能[10-12]。EPA和DHA通常添加到保健食品和婴儿食品中,高含量EPA和DHA可作为药物用于治疗高血脂、动脉硬化等心脑血管疾病[13-15]。制备高纯度EPA和DHA制剂是鱼油深加工的发展方向。由于鱼油脂肪酸组分复杂,同时EPA和DHA又属于热和化学不稳定物质,很容易发生聚合、降解、氧化反应,且二者的沸点也高,这使得鱼油中EPA和DHA的分离提纯不易。目前,鱼油中EPA和DHA的富集方法主要有尿素包合法[16-17]、有机溶剂萃取法[18]、超临界CO2萃取法[19-20]、低温结晶法[21]、脂肪酶浓缩法[22]、高效液相色谱法[23]以及蒸馏法[24]等。其中尿素包合法可从鱼油中去除饱和及低不饱和脂肪酸从而使EPA和DHA含量升高,且操作简便、成本低,不在高温下进行,被广泛应用。分子蒸馏技术具备了常规方法不可比拟的优点,受热时间较短、分离程度较高,能极好地保证物料的天然品质而广泛应用于天然油脂的深加工工艺中。但分子蒸馏很难去除分子量与目标组分相同的杂质,故联合上述两种方法可达到更显著的效果[25-27]。从鱼粉加工压榨液中富集多不饱和脂肪酸的研究鲜见报道。鱼粉加工压榨液经离心分离或静置分离所得毛鱼油,经过精制、富集,得到富含DHA、EPA的鱼油,将具有广阔应用前景。本实验室前期已对鱼粉加工压榨液中蛋白源进行了开发利用,在此基础上对压榨液中多不饱和脂肪酸进行富集,将有助于鱼粉加工副产物的全值利用。因此,本文以鱼粉加工压榨液为原料,在制备得到精制鱼油的基础上,分别通过尿素包合和分子蒸馏获得高含量的DHA和EPA,然后联用上述两种方法,考察DHA和EPA的富集效果,以期为鱼粉加工压榨液的高值化利用提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鱼粉加工压榨液 宁波裕天海洋生物科技有限公司;混合脂肪酸甲酯标品 美国Supelco公司;无水乙醇、尿素、氢氧化钠等 均为分析纯,中国医药(集团)上海化学试剂厂。

R-3旋转蒸发仪 瑞士Buchi公司;5702R低温离心机 德国Eppendorf公司;VKL70-4分子蒸馏仪 德中瑞达工艺设备(北京)有限公司;Trace1300 GC-MS仪 美国热电公司。

1.2 实验方法

1.2.1 鱼粉加工压榨液中鱼油的提取制备 参照李冲冲等[28]的方法,对鱼粉加工压榨液中的鱼油进行提取精制。鱼粉加工压榨液采用静置分离的方法提取鱼油,在密封储藏罐内静置4 h后用蠕动泵吸取上层鱼油。称取所需量的鱼油于烧杯中,水浴加热搅拌至70 ℃,按1%(v/v)的添加量缓缓加入浓度为60%磷酸溶液(v/v),混合均匀后于70 ℃水浴5 min,然后4500 r·min-1离心10 min得到脱胶鱼油;将脱胶鱼油水浴加热搅拌至65 ℃,按3%(v/v)的添加量缓慢加入浓度为12%的NaOH溶液(m/v),搅拌均匀,在65 ℃下加热15 min,然后以4500 r·min-1离心10 min得到脱酸鱼油;将上述脱酸鱼油置于60 ℃水浴中,缓慢加入15%活性炭(m/v),不断搅拌20 min,真空抽滤,分离出油层即为脱色鱼油;将脱色鱼油放入圆底烧瓶中,利用旋转蒸发仪加热85 ℃,在5 kPa真空度下蒸馏10 min,即得精炼鱼油。精炼鱼油得率(%)=精炼鱼油(g)/毛鱼油(g)

1.2.2 精炼鱼油的乙酯化 取一定量上述精炼鱼油置于圆底烧瓶中,按鱼油/溶剂比2∶1 (v/v)将2 mol·L-1KOH-无水乙醇混合液分批加入到圆底烧瓶中,于75 ℃恒温水浴;冷却后置分液漏斗,静置分层;然后缓慢加入2% NaCl溶液(m/v),至溶液呈中性;收集上层油相,旋转蒸发去除油相中的乙醇和蒸馏水,得到乙酯化鱼油。乙酯化鱼油得率(%)=乙酯化鱼油(g)/精炼鱼油(g)

1.2.3 尿素包合工艺 称取一定量尿素置于烧杯中,加入一定比例的溶剂(95%乙醇),65 ℃下使尿素溶解充分后,往尿素-乙醇饱和溶液中以一定比例缓缓加入乙酯化鱼油,在65 ℃加热至溶液变澄清,然后缓慢冷却至室温,密封后在低温下包合结晶一段时间,然后4 ℃下离心(3200 r·min-1,5 min)分离,取液相旋转蒸发去除溶剂,加少量无水硫酸钠去水分,得到尿包鱼油,并采用气质色谱测定其脂肪酸组成及EPA和DHA含量。

EPA或DHA得率(%)=尿包鱼油中EPA或DHA的质量(g)/原料鱼油中EPA或DHA的质量(g)×100

1.2.3.1 尿脂比的确定 称取15 g乙酯化鱼油,以75 mL的95%乙醇为溶剂,按不同比例加入尿素,使尿素鱼油质量比(m/m)分别为0.5∶1、1∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1,在0 ℃静置结晶12 h。

1.2.3.2 溶剂用量的确定 称取15 g乙酯化鱼油、15 g尿素,以95%乙醇为溶剂,使溶剂与鱼油的比例(v/m)为3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1,在0 ℃静置结晶12 h。

1.2.3.3 结晶温度的确定 称取15 g乙酯化鱼油、15 g尿素,以75 mL的95%乙醇为溶剂,分别在-10、-5、0、5、10 ℃的条件下包合12 h。

1.2.3.4 结晶时间的确定 称取15 g乙酯化鱼油、15 g尿素,以75 mL的95%乙醇为溶剂,在0 ℃条件下分别包合5、10、15、20、25 h。

1.2.3.5 包合次数的确定 称取30 g乙酯化鱼油、45 g尿素,在0 ℃条件下包合1、2、3次,每次包合溶剂用量与鱼油用量比例为6∶1 (v/m),结晶时间为20 h。

1.2.4 分子蒸馏工艺优化 将适量乙酯化鱼油加入分子蒸馏仪的进料器中,进行预热和抽真空,系统各设定值稳定后,进行分子蒸馏,使物料以一定流速进入蒸发系统,蒸馏结束后记录轻相和重相的重量,密封保存蒸馏产品以备分析。分别设定蒸馏温度、刮膜器转速、进料速率、压力、蒸馏级数等参数,优化分子蒸馏工艺。

重相即为分子蒸馏鱼油,采用气相色谱-质谱法测定其脂肪酸组成及EPA和DHA含量。

重相回收率(%)=重相收集到鱼油的质量(g)/重相收集到的鱼油理论质量(g)×100

其中,理论质量(g)=原料鱼油中EPA和DHA的质量(g)/重相鱼油中EPA和DHA的含量。

1.2.4.1 蒸馏温度的确定 设定预热温度60 ℃,进料流速2 mL·min-1,刮膜器转速250 r·min-1,压力5 Pa,蒸馏温度分别为90、100、110、120、130 ℃,进行分子蒸馏,得到重相鱼油。

1.2.4.2 刮膜器转速的确定 设定预热温度60 ℃,进料流速2 mL·min-1,蒸馏温度110 ℃,压力5 Pa,刮膜器转速分别为200、250、300、350、400 r·min-1,进行分子蒸馏,得到重相鱼油。

1.2.4.3 进料速率的确定 设定预热温度60 ℃,刮膜器转速250 r·min-1,蒸馏温度110 ℃,压力5 Pa,进料速率分别为1、2、3、4、5 mL·min-1,进行分子蒸馏,得到重相鱼油。

1.2.4.4 压力的确定 设定预热温度60 ℃,刮膜器转速250 r·min-1,蒸馏温度110 ℃,进料速率2 mL·min-1,压力分别为2.5、5、15、25 Pa,进行分子蒸馏,得到重相鱼油。

1.2.4.5 蒸馏级数的确定 设定预热温度60 ℃,刮膜器转速250 r·min-1,蒸馏温度110 ℃,进料速率2 mL·min-1,压力5 Pa,试验中每次分离得到的重组分重新加入进料器,进行下一级分离操作。

1.2.5 尿素包合法和分子蒸馏法的联用 称取一定量的乙酯化鱼油,先进行一次尿素包合,得到液相中的尿包鱼油,然后对尿包鱼油进行2级分子蒸馏,获得重组分,通过GC-MS分析鱼油中EPA和DHA含量。

1.2.6 鱼油理化指标检测 鱼油不皂化物、过氧化值、酸价、碘价、水分及挥发物等理化指标的测定参考鱼油行业标准SC/T3502-2016[29]。

1.2.7 鱼油中脂肪酸的检测 样品甲酯化参考GB 5009.168-2016[30]中酯交换法,酯化完成后,进行GC-MS分析,通过标准品比对进行定性,采用归一化法对其定量。GC条件:色谱柱采用TG-5MS气相毛细柱(30.0 m×0.25 mm×0.25 μm),载气He,不分流进样,进样量为1 μL,进样口温度250 ℃,采用升温程序,70 ℃保持5 min,然后以每分钟5 ℃升温至280 ℃,保持5 min。MS条件:接口温度250 ℃,离子源温度210 ℃,质量扫描范围45～450 m/z,溶剂延迟5 min。

1.3 数据统计分析

所有数据采用Microsoft Excel进行处理分析及作图。其中,所有数据均取3次平行测量的平均值。

2 结果与分析

2.1 鱼粉加工压榨液中鱼油制备及乙酯化

精炼鱼油得率为45.3%,脂肪酸分析表明,精炼后鱼油多不饱和脂肪酸总含量为0.69 g·mL-1,DHA和EPA含量分别为0.229和0.121 g·mL-1。在进行富集前,鱼油需要进行酯化处理,以降低其极性,精炼鱼油经乙酯化处理后得率为99.3%。以乙酯化鱼油作为原料鱼油进行后继实验。

2.2 尿素包合法富集鱼油中EPA和DHA

由图1A可知,随着尿素用量的增大,液相中EPA和DHA的含量提高,二者得率则随之降低。尿素用量过低,不能有效地包合,但其用量过高,会增加多不饱和脂肪酸与尿素的包合,反而不利于EPA和DHA的富集。实验中当尿素与鱼油比例大于1.5时,虽然液相中EPA和DHA含量增加,但其得率会大幅下降,因此,尿脂比选择1.5∶1为宜。由图1B可以看出,随着溶剂用量的增加,EPA和DHA的得率逐渐增加,溶剂在尿素包合过程中起到两相间传质和提供反应场所的作用,较高的溶剂用量会改善两相间传质的效果,从而提高EPA和DHA的得率[31]。但随着溶剂用量增加,液相中EPA和DHA的含量下降,因此综合考虑,选取溶剂与鱼油比6∶1。

图1 尿素包合因素对液相中 EPA 和 DHA 含量及得率的影响Fig.1 Effects of urea inclusion factors on the content and yield of DHA and EPA in liquid phase 注:A:尿脂比;B:溶剂鱼油比;C:结晶温度;D:结晶时间;E:包合次数。

由图1C可知,随着结晶温度的升高,液相中EPA和DHA含量逐渐降低,而其得率随温度的升高而增大。这是由于尿素包合物的形成是一个结晶放热过程,低温下更有利于包合物形成,尿素能与鱼油中饱和脂肪酸形成稳定包合物,而较高的温度会使包合物不稳定,较多的饱和脂肪酸游离到上清液中,从而使得EPA和DHA含量下降。但温度越低,结晶生成速度越快、晶粒越小,形成的包含物表面积较大,会对EPA和DHA产生较强的包藏作用,使二者得率降低[32]。综合考虑,结晶温度选择0 ℃较为合适。图1D表明,结晶时间对包合效果影响较小,EPA和DHA的含量随结晶时间的延长略微上升,而二者得率则随结晶时间延长缓慢下降,综合考虑结晶时间选择15 h。由图1E可知,随着包合次数的增加，EPA和DHA的含量增大,2次包合后增大趋于平缓,而EPA和DHA的得率则随着包合次数增加快速减小,同时包合次数增加使得试剂用量增加,因此包合次数1次为宜。

2.3 分子蒸馏法富集鱼油中EPA和DHA

从图2A中可以看出,重相产品中EPA+DHA总含量随着蒸馏温度的升高呈上升趋势,其中EPA含量的增长平稳,而DHA含量上升明显。但随着蒸馏温度的增加,重相回收率快速降低。这可能是由于分子平均自由程随着温度的增加而增大,使得重相产品中EPA和DHA的含量逐渐提高,但随着温度升高,部分重组分会因温度过高而分解成轻组分被蒸出,同时重组分黏度增大,黏附在蒸发器壁面上,加速其分解成轻组分,从而降低了重组分的得率[33]。重相回收率的降低不利于工业化生产,因此选用110 ℃作为分子蒸馏的蒸馏温度。刮膜器转子将料液均匀涂布在蒸发器壁面上,从而达到较好的传热传质效果。从图2B可以看出,随着刮膜器转速的增加,EPA+DHA总含量逐渐增加,当转速达到300 r/min后,虽然产品的EPA和DHA含量仍然是上升趋势,但回收率大幅下降,因此刮膜器转速选用250 r/min。

图2 分子蒸馏因素对重相中EPA和DHA含量及回收率的影响Fig.2 Effects of molecular distillation factors on the content of EPA and DHA and the recovery in heavy phase注:A:蒸馏温度;B:刮膜器转速;C:进料速率;D:压力。

进料的速度将影响料液在蒸发器壁面的停留时间,流速小,则停留时间长,物料能充分地被加热,但重组分在蒸馏壁面的长时间停留会使部分重组分被分解为轻组分而蒸出,导致重相回收率大幅降低;而流速过大,停留时间就短,物料未及时加热到蒸馏温度就已经离开蒸发面,将导致产品含量低。由图2C可知,EPA和DHA含量随着进料速率增加而下降,而重相回收率则随进料速率增加而上升,综合考虑选3 mL/min作为分子蒸馏的进料速率,此时,EPA+DHA含量及重相回收率均较为合适。真空度是分子蒸馏的重要参数,当温度一定时,物质的分子平均自由程随压力的降低而增加,从而使冷凝面的组分增加[33]。由图2D可知,随着压力的升高,EPA+DHA含量下降,而重相回收率则大幅上升,这可能是由于压力越小,真空度越高,轻组分越容易蒸出,使得EPA+DHA含量较高,但同时会使重组分在蒸馏壁面停留时间过长而使得其回收率大幅降低。因此,真空度不宜过高或过低,分子蒸馏的压力选取5 Pa。

由表1可知,经一级、二级、三级分子蒸馏重组分中EPA乙酯含量变化幅度不大,而DHA乙酯含量不断提高。经过三级分子蒸馏可得EPA和DHA总含量为63.8%,但重相回收率仅为14.10%。研究表明[24,34],对于多级分子蒸馏,压力越低并不代表蒸馏效果越好,应根据分离要求确定经济合理的工艺参数及操作条件。实验结果表明二级分子蒸馏能取得较好的富集效果,且回收率较高。

表1 多级分子蒸馏对鱼油脂肪酸乙酯组成的影响Table 1 Effect of multi-stage molecular distillation on the composition of fatty acid ethyl ester in fish oil

表2 富集方法对鱼油理化指标的影响Table 2 Effects of enrichment methods on physicochemical properties of fish oil

2.4 鱼油的理化性质分析

酯化鱼油原料呈浅黄色,而富集后的产物颜色较深,呈浅棕红色,其各项理化指标值见表2。尿素包合鱼油中水分及挥发物和不溶性杂质没有达到精制鱼油一级标准(SC/T 3502-2016),说明在尿素包合过程中引入了杂质且挥发物中含有溶剂。与酯化鱼油相比,富集后鱼油的碘值提高较大,说明富集后鱼油不饱和程度高,即EPA和DHA含量较富集前大幅提升。分子蒸馏鱼油的酸值和过氧化值等理化指标较尿包鱼油均有所下降,这可能是由于游离脂肪酸、水分及易挥发物质和酸败产生的一些小分子沸点低,蒸馏过程中进入轻相中。分子蒸馏鱼油的理化指标均达到了精制鱼油的一级标准,而且分子蒸馏鱼油在颜色、外观和气味等方面都得到了改善,所得鱼油呈亮黄色,澄清透明无沉淀物,稍有鱼油特有的腥味,无酸败味。

2.5 鱼油中主要脂肪酸分析

对鱼油中主要脂肪酸进行了分析,结果如表3所示,酯化鱼油中单不饱和脂肪酸主要有C16∶1、C18∶1和C22∶1,总含量为20.58%,EPA和DHA总含量为22.68%。酯化鱼油经过尿素包合富集后,EPA和DHA总含量得到较大提高,含量达65.56%,而饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸主要富集到固相产物中,经检测固相中的EPA和DHA总含量仅为3.49%。

酯化鱼油经分子蒸馏富集后,C18以下的脂肪酸在重相中的含量下降,而C20以上的脂肪酸在重相中占主体,多不饱和脂肪酸的含量达到72.42%,其中EPA和DHA总含量达47.1%。而轻相中C20以上的脂肪酸含量比较低(21.04%)。这样初步实现了将鱼油分成以长碳链不饱和脂肪酸为主的重相和以C14、C16、C18脂肪酸为主的轻相,从而实现以EPA和DHA为主要成分的重相富集。

表3 富集方法对鱼油主要脂肪酸的影响(%)Table 3 Effects of enrichment methods on composition of fatty acids in fish oil(%)

2.6 尿素包合和分子蒸馏结合工艺富集鱼油中EPA和DHA

经一次尿素包合和二级分子蒸馏得到的EPA和DHA含量分别为32.20%和55.30%,二者总含量从22.68%提高到87.50%,EPA+DHA得率为42.02%,且EPA/DHA为0.58。

3 讨论

饱和及低不饱和脂肪酸可与尿素形成稳定的包合物,并在低温下结晶析出,DHA与EPA等多不饱和脂肪酸不易被尿素包合而留在液相中,尿素包合已被广泛用于油脂中多不饱和脂肪酸的富集,由于其所需设备简单,试剂便宜,操作简便,能较好地保留富集物的功能活性,尿素包合已成为一种大规模的、有效的预分离方法。此外,考虑到试剂安全性和包合成本,实验采用乙醇作为尿素包合溶剂。实验表明,鱼粉加工压榨液精炼鱼油经尿素包合后,EPA和DHA总含量得到大大提升,达到65.56%,达到保健鱼油含量要求,且酸值、碘值、过氧化值等均符合精制鱼油一级标准(SC/T 3502-2016);经过二级分子蒸馏后,EPA和DHA总含量(48.3%)低于尿素包合制备所得鱼油,但经三级分子蒸馏后得到的鱼油中EPA和DHA总含量达到63.81%,与尿素包合鱼油相当;尿素包合与二级分子蒸馏联用后,可使EPA和DHA总含量提高至87.50%。EPA和DHA总含量达到28%的鱼油称为多烯鱼油,具有降血脂和健脑等保健功能,中国药典规定当多烯鱼油中EPA与DHA的总含量大于84%,且EPA/DHA为0.4～1时可做为降脂药物[35]。高含量EPA和DHA的多烯酸乙酯药品的临床试验已显示出明显的疗效。尿素包合和分子蒸馏联用制得鱼油中EPA和DHA含量分别为32.2%和55.3%,EPA/DHA约为0.58,达到多烯酸乙酯的要求,具有作为降脂药物的应用潜力,市场前景广阔。富集后的鱼油具有高度不饱和性,对外界环境(如氧、光、热等)极为敏感,易发生氧化裂变,从而影响其功能性,因此,在制备富含ω-3多不饱和脂肪酸鱼油的基础上,后期应系统开展鱼油的稳态化研究,制备稳定性及加工适应性良好的产品,优化其工艺。

4 结论

以鱼粉加工压榨液为原料,采用尿素包合和分子蒸馏的方法富集其EPA和DHA,优化的工艺参数为:以尿素/鱼油1.5∶1 (m/m)、溶剂/鱼油6∶1 (v/m)、0 ℃条件下结晶15 h,进行尿素包合;包合后,以蒸馏温度110 ℃、刮膜器转速250 r·min-1、进料速率3 mL·min-1、压力5 Pa条件下进行二级分子蒸馏;通过上述两个处理过程,EPA和DHA含量由22.68%提高到87.50%,得率42.02%,且EPA/DHA约为0.58。本实验可有效地从鱼粉加工压榨液中制备高EPA和DHA含量的鱼油,从而大大提高鱼粉加工副产物的附加值。