许琮欣，堵嘉诚，杜 彤，谢依彤，王鹏博，戴顺捷，毛海青，杨惠林

（1.苏州大学附属第一医院骨科，江苏 苏州 215006；2.苏州大学医学部，江苏 苏州 215123）

退行性椎间盘疾病（degenerative disc disease,DDD）是导致腰背痛的主要原因之一，其成因复杂，发病原理至今尚不明确[1-2]。髓核细胞（nucleus pulposus cells, NPCs）是髓核组织的细胞成分，其状态直接影响髓核组织的形态与功能[3]。髓核组织的结构与功能退行性变被认为是椎间盘退行性变（intervertebral disc degeneration, IVDD）的主要原因[1]。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide, NAD）是细胞的生命活动中重要的生物小分子[4]。FK866是烟酰胺磷酸核糖转移酶（nicotinamide phosphoribosyltransferase, NAMPT）的特异性抑制剂，阻止细胞内NAMPT利用烟酰胺合成烟酰胺单核苷酸（nicotinamide mononucleotide,NMN）进而阻止NAD的合成代谢[4]。NAD水平的异常可造成多种细胞的生理功能障碍，并导致相关疾病的发生发展[5-7]。然而，NAD的含量是否及如何影响NPCs的退行性变，目前尚不清楚。本研究通过FK866与NMN调节NPCs的细胞内NAD水平，初步阐释NAD合成代谢障碍所致的NAD水平异常波动对NPCs退行性变造成的可能影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：8周龄雄性Sprague Dawley大鼠，SPF级，购自苏州大学实验动物中心。

1.1.2 试剂：DMEM:F12培养基、血清、青链霉素（美国Gibco），Ⅱ型胶原酶、FK866、NMN（美国Sigma-Aldrich），CCK8试剂（日本Dojindo），Trizol、NAD+/NADH检测试剂盒（中国碧云天），逆转录试剂盒（日本Takara），iTaq™Universal SYBR Green Supermix（美国Bio-Rad）。

1.1.3 仪器：酶标仪（美国Biotec），RT-PCR扩增仪、逆转录仪（美国Bio-Rad）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠尾椎NPCs分离：大鼠处死后离断尾部，消毒冲洗后剥脱皮肤及周围组织，逐级切开椎间盘，摘取髓核组织，胰酶37 ℃消化3 min，0.5% Ⅱ型胶原酶（1% FBS）37 ℃消化1 h。37 ℃ F12培养基（15% FBS）重悬后培养。

1.2.2 细胞培养：贴壁NPCs常规使用DMEM:F12完全培养基（10% FBS），37 ℃ 5% CO2恒温恒湿常氧培养箱培养，隔日更换培养基并观察细胞生长情况，至密度约80%时传代。……