赵媛媛，张 楠，孙维义，郅 强

1)河南中医药大学 郑州 450000 2)河南中医药大学第一附属医院微创腔镜外科 郑州 450046

结直肠癌是最常见的消化系统恶性肿瘤，危及人们健康和生命安全，在我国发病率和死亡率逐年上升[1]。结直肠癌的治疗包括手术、化疗、中医药治疗等。黄芪多糖是豆科植物黄芪的主要活性成分，具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化等多种生物活性，尤其是多重抗肿瘤活性作用备受关注[2]。有研究[3-4]报道，黄芪多糖可以通过诱导肿瘤细胞凋亡、调节免疫状态、抑制新生血管形成、抑制肿瘤细胞侵袭和转移等多种机制发挥广谱抗肿瘤作用。结直肠癌的生长与多种炎性因子关系密切，其中白介素17(interleukin-17，IL-17)参与炎症反应和免疫反应，在结直肠癌患者血清中高表达，促进结直肠癌的发生发展[5]。IL-17主要由Th17细胞产生，在转化生长因子β1(transforming growth factor beta 1，TGF-β1)和IL-6共同诱导下，通过TGF-β1信号转导和转录激活因子3及干扰素调节因子4，调节诱导CD4+T细胞向Th17细胞分化[6-7]。结直肠癌组织中TGF-β1含量升高与结直肠癌恶性程度、增殖及侵袭转移能力密切相关[8]。目前有研究表明黄芪多糖能够体外抑制结直肠癌HCT-116细胞侵袭和迁移[3]，体外抑制结直肠癌HT-29细胞增殖[9]。然而，黄芪多糖在体内抗结直肠癌活性及其具体抗肿瘤机制尚不清楚。本研究拟探讨黄芪多糖对BALB/C裸鼠结直肠癌移植瘤生长的影响及相关机制。

1 材料与方法

1.1实验细胞、动物和主要材料HCT-116细胞由山东大学病理实验室提供；SPF级雄性BALB/C nu/nu裸鼠购自郑州市惠济区华兴实验动物养殖场，实验动物合格证号SCXK(豫)2019-0002。RPMI 1640培养基、胰蛋白酶细胞消化液、胎牛血清和青霉素-链霉素溶液均购自Biosharp公司，PBS购自HyClone。注射用黄芪多糖购自天津赛诺制药有限公司，氟尿嘧啶注射液购自上海旭东海普药业有限公司，生理盐水注射液购自河南科伦药业有限公司。小鼠血清IL-17和TGF-β1 ELISA试剂盒购自CUSABIO公司，HE染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2HCT-116细胞培养及结直肠癌移植瘤模型的建立HCT-116细胞用含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，于37 ℃、体积分数5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养，生长至约90%融合时进行传代或冻存，取3代后的细胞用于后续实验。

收集处于对数生长期的HCT-116细胞，用无血清RPMI 1640培养基重悬制备细胞悬液，调整细胞密度为1×107个/mL。用1 mL注射器吸取0.2 mL细胞悬液注射至BALB/C裸鼠腋下稍偏背侧。接种肿瘤细胞后，观察裸鼠饮食、精神和活动状态。

1.3实验动物分组及处理接种第10天，将接种部位皮下结节体积大于62.5 mm3的裸鼠按照随机数字表法分为3组：模型对照组、黄芪多糖组和氟尿嘧啶组，每组10只。模型对照组腹腔注射生理盐水(20 mL/kg)，1次/d，连续21 d；黄芪多糖组给予黄芪多糖(250 mg/kg)，腹腔注射，1次/d，连续21 d；氟尿嘧啶组给予氟尿嘧啶(200 mg/kg)，腹腔注射，1次/周，连续3周。

1.4观察指标

1.4.1 裸鼠体重及瘤体体积测量 实验期间用电子天平称量裸鼠体重，游标卡尺测量移植瘤长径(a)、短径(b)，按照体积公式V=1/2(ab2)计算移植瘤体积，造模后每3 d测量1次。

1.4.2 血清IL-17、TGF-β1水平的ELISA法检测 给药21 d后，裸鼠用体积分数4%水合氯醛麻醉，心脏取血，静置1 h，3 000 r/min离心10 min，取血清备用。参照ELISA检测试剂盒说明书操作步骤，检测血清TGF-β1、IL-17水平。

1.4.3 裸鼠瘤体、肝脏的病理学表现 分离裸鼠皮下移植瘤瘤体及肝尾状叶，40 g/L多聚甲醛固定，经石蜡包埋、切片(4 μm厚)、HE染色后，于光学显微镜下观察组织形态结构。

1.5统计学处理采用SPSS 22.0进行数据分析，应用重复测量数据的方差分析比较各组裸鼠移植瘤瘤体生长情况；应用单因素方差分析和SNK-q检验比较3组裸鼠血清IL-17与TGF-β1水平的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1各组裸鼠一般情况及体重变化情况接种后4～7 d开始长出瘤体，30只BALB/C裸鼠均荷瘤成功，早期饮食、体重、精神状态、活动度等情况没有明显改变。随着荷瘤生存时间延长以及药物干预，荷瘤裸鼠体重降低，个别裸鼠出现腹泻；荷瘤期间黄芪多糖组、氟尿嘧啶组各死亡1只。氟尿嘧啶组裸鼠在给药后出现食欲减退、精神活动差、皮肤粗糙、消瘦和体重减轻现象；与氟尿嘧啶组相比，黄芪多糖组裸鼠体重减轻不明显。

2.2各组裸鼠移植瘤瘤体生长变化情况在给药1周后黄芪多糖组瘤体体积明显低于模型对照组(P<0.05)；黄芪多糖组与氟尿嘧啶组比较，瘤体体积差异无统计学意义(P>0.05)，见表1、图1。

表1 各组裸鼠移植瘤瘤体体积比较 mm3

2.3各组肿瘤组织及肝脏组织病理学变化药物干预21 d经麻醉后剥离肿瘤标本，瘤体边界清晰、不规则、质硬，与周围组织粘连致密，剥离后可见完整被膜包被，呈淡粉色。模型对照组肿瘤组织增生、血管增生和细胞异型性明显，肿瘤细胞形状排列不规则，细胞体积偏大(图2A1)；肝尾状叶可见多个散在结节，组织结构紊乱，肝小叶结构破坏，有核大、深染的团状癌组织分布(图2A2、3)。与模型对照组比较，黄芪多糖组肿瘤组织异型性不明显，血管增生少，肿瘤细胞体积小(图2B1)，肝尾状叶未见明显结节、肿瘤转移灶浸润和肝细胞损害(图2B2、3)；氟尿嘧啶组肿瘤组织异型性、血管增生不明显(图2C1)，肝尾状叶细胞肿胀、体积增大，局部可见炎性细胞浸润现象(图2C2、 3)。

A：模型对照组；B：黄芪多糖组；C：氟尿嘧啶组；1：移植瘤镜下观(×100)；2：肝尾状叶大体观；3：肝尾状叶镜下观(×100)

2.4各组裸鼠血清IL-17与TGF-β1水平变化见表2。与模型对照组比较，黄芪多糖组血清IL-17与TGF-β1水平降低(P<0.05)；与氟尿嘧啶组比较，黄芪多糖组血清IL-17水平差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 各组裸鼠血清IL-17与TGF-β1水平比较

3 讨论

黄芪多糖是豆科植物黄芪的主要活性成分，可以有效增强细胞活性，维持细胞的正常结构，降低肺癌患者外周循环髓源性抑制细胞水平，改善机体免疫功能[10]，还可以有效促进抗原递呈的能力，发挥CD8+T细胞的功能，增强机体抑制肿瘤发生与进展的能力[11-12]，表现出多重抗肿瘤作用。

本实验结果显示，黄芪多糖治疗后裸鼠体重降低不明显，瘤体体积生长明显低于模型对照组，肿瘤细胞增殖、侵袭和异型性不明显，肝脏无明显转移灶，这与王旗等[3]干预体外培养人结直肠癌HCT-116细胞抑制肿瘤细胞侵袭和迁移结果一致。与氟尿嘧啶组比较，裸鼠体重减轻幅度小，且肝脏细胞无明显损害。这些结果表明黄芪多糖可通过改善机体免疫应答、提高机体免疫功能发挥体内抗肿瘤作用。

肿瘤在体内生长不仅依赖于肿瘤细胞自身的生长，还与血管等其他因素密切相关。体内实验影响因素广泛，更能有效拟合真实世界，尤其是肿瘤对机体的整体影响，更能直观观察侵袭性转移。IL-17可能通过局部炎症导致肿瘤细胞生存、增殖，形成一个有利于肿瘤细胞生长的免疫微环境，并通过促进肿瘤血管的生成促进肿瘤的生长和转移[13]。TGF-β1是血管生长的重要标志因子，通过激活肿瘤相关成纤维细胞促进肿瘤新生血管生成，促进肿瘤生长和转移[14]。本研究结果显示，与模型对照组相比，黄芪多糖治疗后裸鼠血清IL-17和TGF-β1蛋白表达水平降低，这表明黄芪多糖可能通过抑制裸鼠体内IL-17和TGF-β1蛋白表达从而达到抗结直肠肿瘤生长和转移的作用。

综上所述，本研究结果表明，黄芪多糖是高效低毒的抗肿瘤药物，并且抗肿瘤作用与TGF-β1和IL-17蛋白密切相关。这为下一步探索黄芪多糖对肿瘤生长转移作用机制的研究提供了实验基础。