付 雨，王新新，刘 晗，项舒雅，王雪晶,丁雪冰

1)郑州大学第一附属医院神经内科 郑州 450052 2)河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室 郑州 450052

单纯疱疹病毒脑炎(herpes simplex virus encephalitis，HSE)是由单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)感染引起的一种急性中枢神经系统(central nervous system，CNS)感染性疾病，是CNS最常见的病毒感染性疾病[1]，全球发病率为0.02‰～0.04‰[2]。该病病死率及致残率较高，且后遗症较多，预后较差[3]。近年来，肠道炎症与中枢神经系统疾病的关系被广泛认知[4]。有研究[5]证实肠道炎症可通过肠-脑轴激活小胶质细胞，促进其分泌炎症因子，进而增加血脑屏障(bood-brain barrier，BBB)通透性，加重BBB功能障碍。但目前，HSE患者肠道炎症改变尚不明确，且评估其预后的方式有限。本研究通过ELLSA法测定了HSE患者粪便中炎症相关指标[粪钙卫蛋白(fecal calprotectin,FC)、粪α-1-抗胰蛋白酶(fecal alpha-1-antitrypsin,FAT)、粪连蛋白(fecal zonulin,FZ)、粪乳铁蛋白(fecal lactoferrin,FLF)]及血清中炎症相关指标[脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、脂多糖结合蛋白(lipopolysaccharide binding protein,LBP)]的水平，并对部分HSE患者进行肠黏膜活检，评估肠道炎症在HSE中的作用，探索HSE潜在的治疗策略。

1 对象与方法

1.1研究对象收集2018年9月至2020年5月郑州大学第一附属医院神经内科收治的65例由两位神经科专家根据临床表现及各项辅助检查确诊的HSE患者。研究纳入标准：①有典型HSE临床表现且脑脊液单纯疱疹病毒抗体阳性。②同意配合粪便样本及血液样本检测，并签署知情同意书。③在发作的急性期采集粪便及血液标本。排除标准：①近3个月内曾使用抗病毒、抗菌类药物、益生菌类药物、激素类药物等。②既往有胃肠道疾病史、内分泌系统疾病史、肝脏疾病史、心脑血管疾病史、重金属中毒史等[6]。65例中男33例，女32例，年龄26～49(40.6±15.4)岁。根据入院时改良Ranking量表(mRS)评分将HSE患者分为轻度神经功能障碍组(A组，mRS评分为1或2分，n=11)、中度神经功能障碍组(B组，mRS评分为3或4分，n=15)和严重神经功能障碍组(C组，mRS评分为5分，n=39)。选取同期65名健康对照者，均自愿参与本研究，且均为患者直系亲属、配偶或处于共同生活环境者，其中男32例，女33例，年龄28～52(49.5±11.8)岁。各组在性别、年龄、体重、职业、既往史等方面均衡，组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2分析指标

1.2.1 临床特征 收集研究对象的临床信息，包括姓名、性别、年龄、体重、职业、既往史、入院时mRS评分。

1.2.2 粪便及血液标本的收集及检验 收集HSE患者急性发作期(治疗前)粪便标本(1 g)，加入9 g中性磷酸盐缓冲液(Life Technologies公司)，用匀浆器充分匀浆，3 000 r/min离心10 min后取上清液，分装并置于-80 ℃冰箱待检，于2 h内送检。收集HSE患者急性发作期(治疗前)肘部静脉血10 mL，3 000 r/min离心10 min后取上清液，分装并置于-80 ℃冰箱待检，于2 h内送检。健康对照者留取晨起首次粪便标本及静脉血，处理同上。粪便中FC、FAT、FZ、FLF和血清中LPS、LBP水平均采用ELLSA法检测，试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司及南京建成生物工程研究所。实验操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.3 电子结肠镜及肠黏膜组织病理学分析 A、B、C 3组各有2例及5名健康对照者接受电子结肠镜及肠黏膜组织病理学检查，并签署相关知情同意书。电子结肠镜检查由同一位内镜医师完成。检查前清洁肠道，检查中取2～3块黏膜粗糙处组织，首先将组织固定于体积分数4%甲醛溶液中，常规脱水、石蜡包埋、4 μm厚切片、常规HE染色，普通显微镜下观察。

1.3统计学处理采用SPSS 26.0对数据进行分析。应用两独立样本t检验比较HSE组与健康对照组LPS、LBP、FC、FAT、FZ和FLF水平的差异，应用单因素方差分析和LSD-t检验比较3组HSE患者LPS、LBP、FC、FAT、FZ、FLF水平的差异。应用Pearson分析HSE患者血清LPS、LBP与粪便FC、FAT、FZ、FLF之间的相关性。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1HSE组与健康对照组LPS、LBP、FC、FAT、FZ和FLF水平比较见表1。

表1 HSE组与健康对照组LPS、LBP、FC、FAT、FZ和FLF水平比较

2.2A、B、C3组HSE患者LPS、LBP、FC、FAT、FZ、FLF水平比较见表2。

表2 A、B、C 3组HSE患者LPS、LBP、FC、FAT、FZ、FLF水平比较

2.3HSE患者血清LPS、LBP水平与粪便FC、FAT、FZ、FLF水平之间的相关性分析见表3。

表3 HSE患者血清LPS、LBP水平与粪便FC、FAT、FZ、FLF水平之间的相关性分析

2.4肠黏膜组织病理学结果6例HSE患者肠黏膜均显示出不同程度的黏膜慢性炎症，间质伴有不同程度的淋巴细胞、浆细胞及中性粒细胞浸润，腺体轻度反应性增生，少许腺体破坏、变形；5例健康对照者肠道黏膜组织病理学未见明显异常。见图1。

A：C组HSE患者；B：健康对照者

3 讨论

近年来，随着肠-脑轴的发现[7]，肠道炎症被证实与多种中枢神经系统疾病相关[8-9]。HSE是全球散发性坏死性脑炎最常见的疾病之一，其发病原因与HSV感染相关[10]。HSV优先潜伏在周围神经节，各种刺激均可诱发病毒的激活，但病毒进入CNS的具体机制尚不明确，目前普遍被接受的病毒入侵途径包括神经轴突运输和血行播散等[11]，而肠道炎症反应可能是病毒入脑的环境因素之一。

肠道与神经元之间存在复杂的相互关系，两者可通过免疫反应、细胞因子及激素的释放等方式形成双向信号传递[12-14]。既往研究[15-16]认为肠道炎症反应时肠黏膜通透性的增加可引起肠道菌群移位，间接引起CNS先天性和适应性免疫应答反应，导致脑组织损伤。一些菌群代谢产物如短链脂肪酸也可直接穿过BBB影响大脑功能。此外，肠道固有层中存在大量γδ T细胞，这些细胞在肠道炎症反应时可分泌IL-17等炎症因子，加重脑组织损伤[17]，与此同时还可能引发肺炎、败血症等感染性疾病。相反，CNS的损伤对肠道亦有一定的影响，比如通过激活肠道免疫反应，引起肥大细胞释放组胺等炎症介质，促进肠黏膜上皮细胞的凋亡及杯状细胞的减少等一系列反应，最终使肠黏膜通透性增加，从而形成恶性循环[18]。

肠道炎症反应可促进LPS的分泌及移位，LPS是革兰阴性菌细胞壁的主要成分，是一种内毒素，在LBP作用下与靶细胞受体结合产生一系列反应[19]。LPS可激活酪氨酸激酶家族EphrinA1/EphA2信号转导通路，降低肠紧密连接蛋白Zoccludin和ZO-1的表达，导致肠屏障功能受损，进而加重肠道炎症反应[20-21]。LPS也具有一定的神经毒性，在脑微血管内皮细胞中存在的LPS跨膜受体——Toll样受体，可将LPS的刺激信号向细胞内传递，导致内皮细胞损伤，进而增加BBB通透性，诱发脑水肿，加重CNS炎症反应[22]。BBB通透性增加后可促进神经毒素及病原体微生物入脑，进一步推动HSE的发病及病情进展。除此之外， LPS可刺激白细胞和内皮细胞产生促炎因子，如白介素、TNF-α、前列腺素等，引发炎症级联反应，加重全身感染，最终导致休克或死亡[23-25]。

目前，大量文献[9,26-27]报道肠道炎症在中枢神经系统疾病中起到某种促进作用：一方面肠道炎症反应可激活肠-脑轴，最终导致BBB通透性增高和功能障碍，加速病毒及炎性因子入脑；另一方面，肠道炎症间接促进血清LPS和LBP的分泌，进一步促进全身炎症反应的发生，甚至形成全身级联炎症反应，加快疾病的进展。FC、FAT和FZ是反映肠道炎症及肠黏膜通透性的重要指标，且其水平与肠道炎症严重程度呈正相关。本研究结果显示，6例HSE患者肠黏膜活检均显示不同程度的炎症反应，HSE患者粪便中肠道炎症指标水平增高，且严重神经功能障碍组>中度神经功能障碍组，中度神经功能障碍组>轻度神经功能障碍组。表明肠道炎症可能参与了HSE的发病及病情进展，且肠道炎症严重程度可间接预警HSE患者的病情严重程度，但具体机制仍需大量研究证实。

综上所述，肠道炎症与HSE相关，动态监测粪便FC、FAT和FZ及血清LPS、LBP的变化可能对HSE患者病情评估起到一定预警作用。而减轻肠道炎症反应可能成为改善HSE患者病情的新的切入点。本研究的不足之处在于研究样本量较小，故肠道炎症反应在HSE发病及病情进展中的作用有待扩大样本量进一步研究证实。