於卫东, 刘永康, 罗雨嘉, 黄 镇, 周 泰,叶 林, 唐 斌, 王世贵,*

(1. 杭州师范大学生命与环境科学学院, 杭州 310036; 2. 浙江鼎益生物科技有限公司, 浙江衢州 324100)

一直以来水稻严重地遭受着害虫的威胁，尤其是过去10年稻飞虱大暴发，导致水稻产量大幅度下降(Rashidetal., 2017)。其中褐飞虱Nilaparvatalugens是一种典型的水稻单食性害虫，主要利用其刺吸式口器吸食水稻茎部汁液，导致水稻丧失营养和水分，变黄变枯，从而减穗减重甚至绝收。褐飞虱生命周期短，繁殖力强，具有远距离迁飞性等特点(Qietal., 2014; Sunetal., 2014; Vongpaetal., 2016; Jingetal., 2017)。杀虫剂是当前农业生产中控制褐飞虱最为主要的手段。但是杀虫剂长期以来的不合理使用带来了 “3R”问题(抗药性、残留和害虫再猖獗)等许多弊端(Wangetal., 2016; 徐红星等, 2017; Sharmaetal., 2018)。

昆虫和哺乳动物的类胰岛素受体(insulin-like receptor, InR)等基因高度相似，其胰岛素调控血糖平衡的通路也非常类似(张龙辉和王国栋, 2014; Kuhnetal., 2015; Zhaietal., 2015)。不同点在于，昆虫的“血糖”是海藻糖。海藻糖是由两个葡萄糖分子通过糖苷键的非还原性二糖，化学结构十分稳定，在昆虫体内广泛存在，由脂肪体合成，作为昆虫的“血糖”而高浓度存在于血淋巴中(Beckeretal., 1996; Tangetal., 2008)。它不仅是昆虫的重要能量物质，而且在昆虫的各种生理活动中发挥着巨大作用，且在抵御寒冷、炎热及干燥等非生物胁迫方面扮演着重要角色(Beckeretal., 1996; Chen and Haddad, 2014; Shuklaetal., 2015)。胰岛素是被研究得最为广泛的肽类激素之一，而昆虫类胰岛素多肽(insulin-like peptides, Ilps)在结构和功能上相对于脊椎动物Ilps来说则是进化上相对保守的。Ilps位于胰岛素信号通路最上游，且在糖类物质调控中发挥关键作用。第一个昆虫Ilp最早是在家蚕Bombyxmori中鉴定出来的，目前为止在家蚕中已经鉴定出了38类编码Ilp的基因(Hetruetal., 1991; Iwani, 2000; Ikeyaetal., 2002; 顾世红和陈建国, 2009)。不同的昆虫所拥有的Ilps的种类和数目也不相同。褐飞虱体内已被鉴定出4种类胰岛素多肽基因(Xuetal., 2015)，它们开放阅读框架长度分别为525, 1 194, 408和405 nt，分别编码174, 397, 135和 134个氨基酸残基(Xueetal., 2020)。发育表达模式研究表明，NlIlp1和NlIlp4主要在胚胎后期表达，NlIlp2和NlIlp3则在卵中的表达水平更高(Xueetal., 2020)。这表明褐飞虱中Ilps的表达具有时空顺序，且各自可能具有独特的功能。对甜菜夜蛾Spodopteraexigua以及豆荚螟Marucavitrata的研究表明Ilp基因影响了昆虫血淋巴的海藻糖水平(Kim and Hong, 2015; Al Bakietal., 2019)，但目前它们在褐飞虱糖类代谢以及发育繁殖中的作用还不清楚。因此，本研究以褐飞虱为实验对象，采用RNAi技术抑制Ilps的表达，观察褐飞虱的表型以及卵巢发育，测定相关糖含量以及海藻糖酶活性，同时检测海藻糖代谢途径关键基因表达量的变化，探讨Ilp对褐飞虱海藻糖代谢及翅和卵巢发育的调控作用，有利于促进类胰岛素调控昆虫血糖的研究。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

以实验室饲养多年的褐飞虱种群作为实验对象，供试水稻品种为感虫水稻TN1(Taichung Native 1)。人工气候箱所设置的温度条件为25±1℃，相对湿度为70%±5%，光周期为14L∶10D。取褐飞虱2日龄雌成虫置于TN1苗上进行产卵，随后取出，以获得生长时期一致的褐飞虱。

1.2 dsRNA合成

取5头褐飞虱成虫进行研磨破碎，随后利用Trizol法抽提褐飞虱总RNA，取1 μL RNA于蛋白核酸微量测定仪NanoDropTM2000中检测总RNA的纯度及浓度，同时进行1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的质量。待抽提的总RNA符合要求后，使用Prime Script RT Reagent Kit(TaKaRa)进行反转录反应合成cDNA第1链。以反转录合成的cDNA第1链为模板，参照Xu等(2015)在褐飞虱Ilp1(GenBank登录号: KF974340.2),Ilp2(GenBank登录号: KF974341.1),Ilp3(GenBank登录号: KF974342.1)和Ilp4(GenBank登录号: KF974343.1)非保守序列区域所设计不含T7启动子的特异性引物(表1)进行PCR，反应体系: 褐飞虱cDNA 4.0 μL, 正反向引物(10 pmol/L)各1 μL, dNTPs(2.5 mmol/L)2 μL, 10×Buffer(Mg2+)2.5 μL, Hifi(5 U/μL)0.2 μL, ddH2O 14.3 μL。反应程序: 95℃预变性 3 min; 95℃变性 5 s, 55℃退火延伸 30 s, 72℃延伸1 min, 共循环35次; 最后在72℃条件下延伸10 min。

表1 dsRNA合成和qPCR所用引物Table 1 Primers used in dsRNA synthesis and qPCR

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，利用试剂盒进行回收与纯化，将纯化产物连接于pMD18-T进行T克隆后送Invitrogen(上海)公司测序。测序结果比对正确后抽提重组质粒DNA，并以此为模板，同时用含T7启动子序列的特异性引物(表1)进行交叉PCR，在序列的两端加上T7启动子。最后以交叉PCR的反应产物为模板，利用T7 RiboMAX Express RNAi System试剂盒进行dsRNA的合成。反应体系为20 μL，包括10 μL T7 RiboMAX Express 2×Buffer, 1 μL PCR反应产物, 2 μL Enzyme Mix以及7 μL DEPC水，具体步骤见试剂盒说明书。随后在合成的dsRNA中加入3 mol/L 醋酸钠(pH 5.2)4.4 μL以及110 μL 95%乙醇，轻轻混匀，冰上放置5 min，在4℃下14 000 r/min离心10 min，弃上清；向离心管中加入0.5 mL 70%的冰乙醇洗涤沉淀，4℃ 14 000 r/min离心10 min，弃上清。最后在室温下干燥离心管10 min 后，加入50 μL DEPC处理水溶解沉淀，分别利用琼脂糖凝胶电泳和蛋白核酸微量测定仪NanoDropTM2000检测dsRNA 的质量和浓度，保存于-80℃备用。

1.3 RNAi实验

随机取出5龄第1天的褐飞虱若虫，用于IlpdsRNA注射实验，包括Ilp1-4单基因dsRNA注射和dsIlp1+dsIlp2+dsIlp3+dsIlp4注射(dsIlp1∶dsIlp2∶dsIlp3∶dsIlp4=1∶1∶1∶1)，同时以注射dsGFP的褐飞虱为对照，每虫注射量为100 nL，其中含200 ng dsRNA。用CO2麻醉5龄褐飞虱30 s，随后用尖头小毛笔将褐飞虱挑起并放置于琼脂糖平板中进行固定。IM-31显微注射仪(NARISHIGE, 日本)参数设置为：注射压强1 000 Pa，注射时间0.5 s，补偿压20 Pa。选择褐飞虱5龄若虫胸部中足和后足间的外侧表皮处进行注射，设3次生物学重复， 每个生物学重复注射50头。

1.4 RNAi后褐飞虱表型特征观察

将1.3节RNAi后褐飞虱5龄若虫放入含水稻茎叶的开口玻璃管中，用棉塞塞住管口，置于人工气候室中，环境条件设置为：温度26±0.5℃，相对湿度50%±5%，光周期16L∶8D。24 h后观察褐飞虱存活情况，同时观察褐飞虱表型并用莱卡显微解剖镜(德国)拍照记录。随机挑选5头雌虫与5头雄虫，放入含新鲜水稻苗的开口玻璃管中，饲养至羽化后第2天和第6天，取褐飞虱雌成虫进行解剖，观察卵巢的发育情况，并用莱卡显微解剖镜进行拍照记录，放大倍数为20×。

1.5 RNAi后褐飞虱体内糖类物质含量以及海藻糖酶活性的测定

分别于RNAi后48 h与72 h 各注射组随机挑选10头褐飞虱，加入200 μL PBS，超声破碎至无块状组织，破碎后加入800 μL PBS，4℃ 1 000×g离心20 min，用于以下测定：取350 μL上清，根据葡萄糖分析试剂盒(Sigma-Aldrich, 美国)说明书进行葡萄糖含量的测定；利用淀粉转葡萄糖苷酶处理含糖原的1 000×上清液后，再根据葡萄糖分析试剂盒说明书检测糖原含量；根据蒽酮法(Zhangetal., 2017)检测海藻糖含量；取350 μL上清，4℃ 20 800×g超离心60 min，上清液与沉淀悬浮液与40 mmol/L海藻糖标准液(Sigma-Aldrich, 美国)进行混合反应，利用葡萄糖标准液制作标准曲线，用标准曲线确定可溶性海藻糖酶(soluble trehalase, TRE1)和膜结合型海藻糖酶(membrane-bound trehalase, TRE2)活性。利用BCA蛋白试剂盒(Beyotime, 上海)测定各部分总蛋白浓度，用于计算糖含量以及酶活性。在测量总蛋白浓度、糖含量以及酶活性时均重复点样3次，进行技术重复。

1.6 RNAi后海藻糖代谢途径基因表达的测定

取RNAi后的褐飞虱5头，RNA提取、检测和反转录合成cDNA同1.2节。参考Xu等(2015)设计qPCR所需引物(表1)，18S rRNA用作内参基因，检测海藻糖酶(trehalase, TRE)基因TRE1-1(GenBank登录号: FJ790319),TRE1-2(GenBank登录号: KU556829),TRE2(GenBank登录号: GQ397451)和海藻糖合成酶(trehalose-6-phosphate synthase, TPS)基因TPS1(GenBank登录号: GQ397450.1)和TPS2(GenBank登录号: KU556826.1)的表达。qPCR反应按照SYBR Premix EX TaqTMⅡ Kit说明书(TaKaRa, 大连)进行，反应体系(10 μL): 正反向引物(10 ng/μL)各0.4 μL, SYBR Buffer 5 μL, ddH2O 3.2 μL, cDNA模板1 μL。每个体系进行3次技术重复。反应置于Bio-Rad CFX96TMReal-time PCR检测仪上进行，反应程序: 95℃预变性3 min; 95℃变性5 s, 59℃退火并延伸30 s, 39个循环。根据溶解曲线检测引物的特异性，最后根据2-△△CT法计算mRNA的相对水平(Livak and Schmittgen, 2001)。

1.7 数据分析

使用IBM SPSS Statistics 20进行统计分析，实验数据以3次生物学重复的平均值±标准误的形式呈现；所有实验组均只与对照组进行比较，采用t检验分析差异显著性；利用SigmaPlot10.0软件制图。

2 结果

2.1 RNAi对褐飞虱Ilp表达的干扰效果

采用RNAi技术分别进行褐飞虱4个Ilp基因的单干扰以及共同干扰的结果表明，与注射dsGFP组相比较，在分别注射dsIlp1-4之后48 h和72 h，相应基因的mRNA表达水平都极显著下降(P<0.01)，在注射dsIlp1+dsIlp2+dsIlp3+dsIlp4之后各Ilp基因的表达同样也极显著被抑制(P<0.01)(图1: A-D)。为了排除脱靶效应的存在，将dsIlp1-4的序列进行比对，结果表明4条dsRNA之间不存在20 bp以上完全一致的序列，证明dsRNA之间不存在脱靶效应。以上结果说明RNAi成功抑制了靶标基因的表达。

图1 Ilp基因 RNAi后对褐飞虱5龄若虫Ilp1 (A), Ilp2 (B), Ilp3 (C)和Ilp4 (D)表达的影响Fig. 1 Effect of RNAi of Ilp genes on the expression of Ilp1 (A), Ilp2 (B), Ilp3 (C) and Ilp4 (D)in the 5th instar nymphs of Nilaparvata lugensdsIlps: dsIlp1+dsIlp2+dsIlp3+dsIlp4. 下同The same below. 图中横线表示对照组(dsGFP注射组)基因表达量。图中数据为平均值±标准误；采用t检验进行处理组与对照组间基因表达量差异显著性检验。The horizontal line in the figure represents the gene expression level in the control group (dsGFP injection group). Data in the figure are mean±SE, and t-test was used to determine the significance of difference in the gene expression level between the treatment group and the control group. *P<0.05; **P<0.01.

2.2 干扰Ilp基因后褐飞虱的翅型和卵巢表型变化

与dsGFP注射组相比较，在注射dsIlp1, dsIlp2, dsIlp4以及dsIlp1+dsIlp2+dsIlp3+dsIlp4之后，褐飞虱翅型出现了向内卷曲的现象，而在注射了dsIlp3之后，褐飞虱的翅型向外展开(图2: A)。参考褐飞虱卵巢分级标准(芦芳等, 2011)，发现被注射dsIlp3以及dsIlp1+dsIlp2+dsIlp3+dsIlp4的褐飞虱卵巢在羽化后第2天仍处于Ⅰ级(乳白透明期)，卵巢小管短而细，透明，粘连不易分散，而其余组别已进入Ⅱ级(卵黄沉积期)初期，出现部分乳白色浑浊；而在羽化第6天后各组褐飞虱卵巢均进入Ⅳ级(产卵盛期)，交配囊内部出现乳白色或淡黄色浑浊，组间差异不大(图2: B)。

图2 Ilp基因单干扰以及混合干扰后褐飞虱翅型(A)以及卵巢(B)发育变化Fig. 2 Changes in wing type (A) and ovarian development (B) of Nilaparvata lugens after single interferenceand mixed interference of Ilp genesDay2, Day6: 分别为成虫羽化后2和6 d (2 and 6 d after adult emergence, respectively). 图中箭头指向褐飞虱翅畸形。Arrows point to deformed wing of N. lugens.

2.3 干扰Ilp基因对褐飞虱3种糖类物质含量的影响

与注射dsGFP对照组相比较，分别注射dsIlp1-4及dsIlp1+dsIlp2+dsIlp3+dsIlp4后48 h葡萄糖含量均显著上升(P<0.05)(图3: B)，72 h后其含量又恢复到与对照组一致的水平。类似地，在注射dsIlp2, dsIlp3以及dsIlp4后48 h糖原含量同样显著上升(P<0.05)，而在注射dsIlp1+dsIlp2+dsIlp3+dsIlp4后72 h糖原含量显著下降(P<0.05)，其他注射组别以及时间点与对照组相比变化不大(图3: C)。此外，在dsIlp3和dsIlp4注射后48 h， 海藻糖的水平显著上升(P<0.05)，但在dsIlp2以及dsIlp4注射后72 h海藻糖含量反而显著下降(P<0.05)，但在注射dsIlp1+dsIlp2+dsIlp3+dsIlp4后48 h和72 h海藻糖含量都显著上升(P<0.05)(图3: A)。

2.4 干扰Ilp基因对褐飞虱海藻糖酶活性的影响

可溶性海藻糖酶的活性在各组dsRNA注射后48 h无显著变化，但在72 h 后均有显著性上升(P<0.05)(图4: A)。膜结合型海藻糖酶的活性在各组dsRNA注射后48 h同样无明显变化，注射72 h后除dsIlp1和dsIlp2组无显著差异变化外，其余注射组活性均显著下降(P<0.05)(图4: B)。

2.5 干扰Ilp基因后褐飞虱海藻糖代谢通路中相关基因的表达变化

结果表明，分别注射dsIlp1-4后48 h和72 h，褐飞虱TRE1-1和TRE1-2表达量显著下降(P<0.05)或者极显著下降(P<0.01)，TRE1-2在dsIlp4注射后72 h表达无显著变化，且dsIlp1+dsIlp2+dsIlp3+dsIlp4注射后TRE1-1表达量同样显著下降(P<0.05)(图5: A-B)。而在dsIlp1和dsIlp4注射后48 h和72 h、dsIlp2注射后48 h、dsIlp3注射后72 h以及dsIlp1+dsIlp2+dsIlp3+dsIlp4注射后48 h，TRE2的表达量同样显著或极显著下降(图5: C)。当分别注射dsIlp1-4以及混合dsIlp1+dsIlp2+dsIlp3+dsIlp4注射后48 h和72 h，除了dsIlp1+dsIlp2+dsIlp3+dsIlp4注射后72 hTPS2表达量未显著下降(P>0.05)外，与注射dsGFP对照组相比较，海藻糖合成酶基因TPS1和TPS2基因的表达量均极显著下降(P<0.01)(图5: D-E)。

图3 RNAi干扰 Ilp基因后对褐飞虱5龄若虫海藻糖(A)、葡萄糖(B)和糖原(C)含量的影响Fig. 3 Effect of RNAi of Ilp genes on the contents of trehalose (A), glucose (B) and glycogen (C)in the 5th instar nymphs of Nilaparvata lugens图中数据为平均值±标准误；采用t检验进行处理组与对照组(dsGFP注射组)间含量差异显著性检验。Data in the figure are mean±SE, and t-test was used to determine the significance of difference in the content between the treatment group and the control group (dsGFP injection group). *P<0.05.

图4 Ilp基因RNAi后对褐飞虱5龄若虫可溶性海藻糖酶(A)和膜结合型海藻糖酶(B)活性的影响Fig. 4 Effect of RNAi of Ilp genes on the activities of the soluble trehalase (A) and membrane-bound trehalase (B)in the 5th instar nymphs of Nilaparvata lugens图中数据为平均值±标准误；采用t检验进行处理组与对照组(dsGFP注射组)间酶活性差异显著性检验。Data in the figure are mean±SE, and t-test was used to determine the significance of difference in the enzyme activity between the treatment group and the control group (dsGFP injection group). *P<0.05.

图5 Ilp基因RNAi后对褐飞虱5龄若虫TRE1-1 (A), TRE1-2 (B), TRE2 (C), TPS1 (D)和TPS2 (E)表达量的影响Fig. 5 Effect of RNAi of Ilp genes on the expression levels of TRE1-1 (A), TRE1-2 (B), TRE2 (C),TPS1 (D) and TPS2 (E) in the 5th instar nymphs of Nilaparvata lugen图中横线表示对照组(dsGFP注射组)基因表达量。图中数据为平均值±标准误；采用t检验进行处理组与对照组间基因表达量差异显著性检验。The horizontal line in the figure represents the gene expression level in the control group (dsGFP injection group). Data in the figure are mean±SE and t-test was used to determine the significance of difference in the gene expression level between the treatment group and the control group. *P<0.05;**P<0.01.

3 讨论

本研究中，在分别注射dsIlp1-4以及dsIlp1+dsIlp2+dsIlp3+dsIlp4后， 4个靶标基因的表达量均极显著下降(图1)，说明本研究中RNAi能够有效抑制靶标基因的表达。除此之外，在注射了某一个dsIlp之后，尽管4个dsIlp所设计的同源性不高，但4个Ilp基因均同时存在不同程度地下调，说明4个Ilp基因功能可能之间存在一定的调节关系。

大多数昆虫Ilps在脑中合成后被分泌到昆虫血淋巴中，然后被转运到特定的组织或细胞中，和细胞膜上相应的类胰岛素受体结合，激发下游信号通路，进而发挥调控昆虫生长、发育、繁殖、代谢、寿命等各个生理活动的作用(Nässeletal., 2015)。前人的研究表明，褐飞虱InR基因通过类胰岛素信号途径决定了褐飞虱的翅型(Xuetal., 2015; Zhangetal., 2019)。在本研究中，当分别注射dsIlp1-4以及dsIlp1+dsIlp2+dsIlp3+dsIlp4之后，褐飞虱均出现了翅型向内卷曲或向外平展的畸形现象(图2: A)，表明褐飞虱4个Ilp基因也可能通过类胰岛素信号途径影响了翅型的正常发育。但并非同一物种体内的不同的Ilp发挥的作用是一样的。对果蝇DrosophilaIlp的研究表明，同一物种所拥有的不同类胰岛素多肽可能具有不同的调控作用(Nässel and Vanden Broeck, 2016)。对褐飞虱的研究同样也证实了这点。对褐飞虱的研究表明Ilp2或Ilp4的敲低可导致脂肪体卵黄蛋白原的减少(Luetal., 2018)，而本研究中Ilp2的沉默同样也导致了褐飞虱产卵量的显著降低(由于除dsIlp2以外注射组生物学重复不足，因此未加入本研究数据)，且Ilp3敲低后出现了雌性褐飞虱卵巢发育相对减缓的现象(图2: B)。这说明Ilp基因可能对褐飞虱繁殖具有重要的调控作用，但还需要通过检测卵黄原蛋白和卵黄原蛋白受体基因转录水平或卵黄原蛋白含量等更进一步的探究来确定Ilp基因在褐飞虱繁殖方面的作用。

昆虫翅型的发育涉及几丁质的合成，而几丁质合成起始于海藻糖(Merzendorfer and Zimoch, 2013; Zhuetal., 2016; Tangetal., 2017)，因此Ilp影响翅型发育的潜在途径可能是海藻糖代谢。众所周知，胰岛素具有降低血糖的作用，而昆虫Ilp是胰岛素的功能类似物，其同样在昆虫体内的糖类物质调控中发挥关键作用(Defferrarietal., 2016)，如甜菜夜蛾SeIlp1 以及豆荚螟MvIlp在RNAi后均能增加血淋巴中海藻糖水平(Kim and Hong, 2015; Al Bakietal., 2019)。本实验结果表明，分别干扰褐飞虱4个Ilp基因或注射dsIlp1+dsIlp2+dsIlp3+dsIlp4后48 h能够引起葡萄糖含量的显著上升(图3: B)；同样dsIlp2, dsIlp3以及dsIlp4注射后48 h能够显著提高糖原的含量(图3: C)，注射dsIlp3和dsIlp4后48 h能够显著提高海藻糖的含量，但Ilp2与Ilp4低表达后72 h海藻糖的含量显著降低(图3: A)。这与其他昆虫体内的Ilp基因类似，不同的Ilp可调节不一样的物质，比如果蝇体内存在7中类胰岛素多肽，其中DIlp2能够调节Ser15处的糖原磷酸化酶(GlyP)的去磷酸化从而调控糖原代谢，而DIlp5对脂质代谢发挥更大作用(Kannan and Fridell, 2013; Postetal., 2018)。在昆虫体内海藻糖生成最常见的途径是6-磷酸海藻糖合成酶(TPS)/6-磷酸海藻糖磷酸酯酶(TPP)途径，即在TPS的催化作用下，尿苷二磷酸(UDP)葡萄糖和6-磷酸葡萄糖合成6-磷酸海藻糖，然后在TPP的作用下发生去磷酸化生成海藻糖(秦加敏等, 2015)。而褐飞虱Ilp低表达后先存在葡萄糖含量升高，后海藻糖含量降低，与TPS/TPP途径一致，但在时期上有所延迟，中间可能存在间接的信号调节，因此本研究在dsRNA注射处理后48 h与72 h糖含量变化存在差异。以上也说明褐飞虱Ilp能够通过改变葡萄糖、糖原等其他糖类物质的含量从而调控海藻糖水平。

海藻糖酶是已知存在唯一能够水解海藻糖的酶类，可分为可溶性海藻糖酶与膜结合型海藻糖酶。褐飞虱体内的可溶性海藻糖酶编码链分为两条，为TRE1-1与TRE1-2(张露等, 2017)。当家蚕幼虫中注射家蚕素II(一种类胰岛素多肽)，其体内海藻糖浓度会降低，且海藻糖酶的活性得到提高(Satakeetal., 1997)，而本研究在蛋白质水平上检测了RNAi后褐飞虱体内海藻糖酶活性，发现当Ilp抑制后48 h可溶性海藻糖酶和膜结合型海藻糖酶活性无显著性变化，但72 h 后可溶性海藻糖酶的活性显著上升，而膜结合型海藻糖酶活性则有所下降(图4)，说明褐飞虱Ilp基因可能通过改变海藻糖酶活性来调控海藻糖代谢，但两种海藻糖酶之间存在拮抗关系，增加了褐飞虱海藻糖代谢的复杂性。随后又在转录水平上利用qRT-PCR检测了3类海藻糖酶基因TRE1-1,TRE1-2与TRE2以及两类海藻糖合成酶基因TPS1与TPS2的表达量，发现除了TRE2在dsIlp3注射后48 h表达上升不显著外，褐飞虱4 个Ilp基因被抑制后会显著或极显著下调TRE与TPS基因(图5)。而相关研究表明褐飞虱TRE1与TRE2被抑制后均能导致褐飞虱异常蜕皮以及翅型变形或卷曲(Zhangetal., 2017)，这和我们的研究结果类似。

综上可知，Ilp基因被抑制后，会引起褐飞虱翅型发育的畸形，且Ilp3的抑制能引起卵巢发育的不完全。此外，对Ilp基因的沉默会导致褐飞虱体内葡萄糖与糖原的代谢发生变化，并且引起海藻糖酶基因与海藻糖合成酶基因表达量的下调，改变海藻糖酶的活性，进而影响海藻糖的代谢。