孙斌杰 王 军 杨倩倩 徐 艳 刘文强

徐州医科大学附属医院新生儿科（江苏徐州 221000）

极低出生体质量儿，作为新生儿中的特殊群体，对生后营养有更高的需求，但由于胃肠道功能发育不成熟，肠内营养往往不能满足生长发育需求，此时肠外营养显得尤为重要[1]。脐静脉置管作为一种中心静脉置管，已有研究证实其能改善早产儿的生后早期营养状况，尤其对于出生体质量更低的早产儿，其在营养方面的优势更为显著[2]，现已广泛应用于极低出生体质量儿。研究表明，正常肠道菌群对促进肠道功能发育，维持和调节肠道黏膜屏障功能，促进免疫系统的发育成熟等方面有着十分重要的作用[3]，但新生儿期的肠道菌群定植受多种因素的影响，如胎龄、喂养、出生方式、医疗操作等[4]。有研究提出脐静脉置管可影响静脉导管关闭，一过性增加门静脉压力，导致肠黏膜相对缺血[5-6]，而肠黏膜缺血可导致肠上皮细胞损伤，肠黏膜屏障功能受损，从而可能增加机会致病菌属、致病菌属定植的机会。现对于脐静脉置管是否影响肠道菌群早期构成的相关研究甚少。本研究通过高通量测序技术，了解脐静脉置管是否对极低出生体质量儿早期肠道菌群产生影响，探讨脐静脉置管对于极低出生体质量儿的潜在风险。

1 对象与方法

1.1 研究对象

以2019 年6 月至2020 年6 月收入新生儿重症监护室的极低出生体质量儿为研究对象。研究对象纳入标准：①出生胎龄＞28周且＜34周，性别不限；②出生体质量＜1 500 g 且≥1 000 g；③分娩方式为剖宫产；④本院产科出生且在生后24小时内入组；⑤至少存活至生后1周；⑥生后1周内喂养早产儿配方奶，喂养方式为间歇鼻饲喂养；⑦生后早期经验性使用头孢噻肟抗感染治疗3天，随访无异常后停用。排除标准：①早期有创呼吸机辅助通气；②存在先天性消化道畸形、遗传代谢性疾病等；③生后7 天内在母乳喂养；④因病情需要生后1 周内使用益生菌或益生元；⑤患儿母亲存在严重感染病史或产前24 小时内使用抗 生素。

本研究征得患儿家长知情同意签字，并经徐州医科大学附属医院医学伦理委员会审核通过。

1.2 方法

1.2.1 样本采集 收集极低出生体质量儿生后第1、3、7天的粪便至少0.25g，在24小时内用冻存管收存，放入-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 粪便菌群检测 ①DNA提取：采用PowerSoil DNA提取试剂盒（Mobio，美国），提取0.25 g粪便样本中微生物总DNA，实际步骤按照试剂盒说明书进行。②PCR扩增：使用AB 9902®96well PCR仪，KOD FX Neo DNA 聚合酶，对粪便样本 DNA 进行 16 S rDNA 的PCR 扩增。以引物27 F（5’-AGR GTT TGA TYN TGG CTC AG-3’）和1492R（5’-TAS GGH TAC CTT GTT ASG ACTT-3’）对16S rDNA的全长进行扩增。扩增条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30次循环，72 ℃延伸7 min停止。PCR扩增产物使用1.8%琼脂糖凝胶进行电泳检测，结束后凝胶成像，并用ImageJ软件定量，检测合格的PCR产物使用全式金磁珠回收纯化，具体流程严格按照说明书操作。③高通量测序：检测合格的PCR扩增产物在 Illumina Miseq平台上进行16S基因全长测序。④生物信息学分析：对测序所得的原始序列进行校正，去除嵌合体，得到高质量序列，在相似性为97%的水平上进行聚类，得到操作分类范围（OTU），利用得到的OTU序列在细菌16S的Silva数据库中进行比对，获得物种信息，并进行生物信息学分析。

1.3 统计学分析

符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用两独立样本t检验。非正态分布计量资料以中位数（四分位数范围）表示，组间比较采用Wilcoxon秩和检验。计数资料以例数（百分比）表示，组间比较采用χ2或校正χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

研究期间入院113 例极低出生体质量儿，排除病情危重有创呼吸机辅助通气32 例，生后1 周内死亡5例，未能按照时间点采取粪便样本9例，生后1周内存在母乳喂养5例，生后早期感染加重更换抗生素15例，患儿母亲存在产前抗生素使用史5 例，顺产1 例，最后41例纳入本研究。入选的41例新生儿中，男26例、女15例，出生胎龄30.0（29.3～30.6）周，出生体质量（1.25±0.10）kg。

根据患儿脐残端情况及家属知情同意，共24例纳入脐静脉置管组，其余17例为非脐静脉置管组；同时非脐静脉置管组未进行经外周中心静脉置管，排除其他中心静脉置管干扰，肠外静脉营养均为24小时持续泵入。

脐静脉置管组第1、3、7 天成功从样本提取DNA并完成测序分别为2、15、21份，非脐静脉置管组分别为1、11、15份。因第1天粪便样本DNA提取率较低，其结果不予统计分析。

脐静脉置管组与非脐静脉置管组之间胎龄、出生体质量，1分钟及5分钟Apgar评分，性别比，开奶时间，生后早期无创呼吸机辅助通气类型差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.2 两组肠道菌群多样性比较

脐静脉置管组与非脐静脉置管组之间第3 天的shannon指数差异无统计学意义（P＞0.05）。而在第7天，脐静脉置管组的shannon指数明显低于非脐静脉置管组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

2.3 两组肠道菌群门水平比较

脐静脉置管组与非脐静脉置管组的粪便菌群均以变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门为主。第3 天两组间各菌门相对丰度差异无统计学意义（P＞0.05）。第7天脐静脉置管组变形菌门相对丰度大于非脐静脉置管组，厚壁菌门及放线菌门相对丰度小于非脐静脉置管组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

2.4 两组肠道菌群属水平比较

两组样本均以克雷伯菌属、莫拉菌属、肠球菌属、链球菌属、乳杆菌属、拟杆菌属、双歧杆菌属为主要菌群，第3 天两组间各菌属相对丰度差异无统计学意义（P＞0.05）。第7 天脐静脉置管组克雷伯菌属相对丰度大于非脐静脉置管组，双歧杆菌属及肠球菌属相对丰度均小于非脐静脉置管组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表1 两组极低出生体质量儿一般情况比较

表2 两组极低出生体质量儿各时间段菌群多样性比较

表3 两组极低出生体质量儿各时间段主要细菌门水平相对丰度比较

表4 两组极低出生体质量儿各时间段主要细菌属水平相对丰度比较

3 讨论

人体肠道是细菌定植的主要场所，其所含有的细菌数量超过1014，是人体细胞数量的10～100倍[7]，具有数量巨大，多样化，复杂性和动态性的特点[8]。正常的肠道菌群定植与宿主存在共生关系，有助于肠道功能发育、能量储存与吸收、维持和调节肠道黏膜屏障功能、促进宿主免疫系统的发育、抵抗病原体入侵 等[3,9]。但新生儿期肠道菌群构成简单，容易受到多种因素的影响，如胎龄、分娩方式、生活环境等[10]，直至3 岁左右，才能建立起一个相对稳定的肠道微生态体系[11]。早产儿，尤其是极低出生体质量儿，由于其体质量低下，胃肠道功能发育不成熟，生后立即入住新生儿重症监护病房。由于肠道喂养延迟，抗生素使用以及受到多种医疗操作的影响，极低出生体质量儿肠道菌群的组成势必存在不同。研究已表明极低出生体质量儿易发生坏死性小肠结肠炎、败血症，可能与其独特的肠道菌群构成有关[12-13]。

脐静脉置管作为一种中心静脉置管，相比于经外周中心静脉置管、外周静脉置管，有其独特的优势[2,14]，在临床上被广泛应用。相关研究提出脐静脉置管可影响静脉导管关闭，一过性增加门静脉压力，导致肠黏膜相对缺血，进而引起坏死性小肠结肠炎的发生[5-6]。而坏死性小肠结肠炎的发生又与肠道菌群息息相关，不排除脐静脉置管通过引起肠黏膜缺血而导致肠上皮细胞损伤，肠黏膜屏障功能受损，从而增加机会致病菌属、致病菌属定植，致使肠道菌群构成发生改变。本研究旨在通过高通量测序技术测定极低出生体质量儿的肠道菌群构成，来思考脐静脉置管这一侵入性操作对于患儿的潜在风险。

极低出生体质量儿作为一个特殊群体，其喂养不耐受发生率高达70%[15]。由于极低出生体质量儿胃肠道功能发育不成熟、生后处于新生儿重症监护病房相对无菌环境中、抗生素应用、常规氧疗（影响肠道的相对无氧环境）[16]，均导致肠道菌群构成与正常足月儿不同。既往已有研究证实喂养不耐受的发生与肠道菌群多样性下降存在联系[16]，同时克雷伯菌属相对丰度在喂养不耐受患儿中明显升高，考虑克雷伯菌可能作为诊断喂养不耐受的标志物[17]。其机制可能是克雷伯菌属过度生长，影响肠-脑轴的功能，打破肠道菌群平衡，导致肠上皮细胞损伤，抑制消化吸收功能，从而导致机体发生喂养不耐受[18]。本研究结果发现生后第3天两组肠道菌群多样性及克雷伯菌属相对丰度无显著差异，而在第7 天脐静脉置管组菌群多样性明显下降，且克雷伯菌属相对丰度明显高于非脐静脉置管组，这表明脐静脉置管可能影响患儿肠道菌群构成，降低菌群多样性从而增加喂养不耐受的发生 风险。

虽然随着医疗技术进步，危重患儿的救治能力逐渐提高，但新生儿败血症，尤其是新生儿晚发型败血症，其发病率与致死率仍处于较高水平；且其发病率与新生儿出生体质量、胎龄存在负相关关系。在极低出生体质量儿中晚发型败血症发病率可达20%以上，同时死亡率可至18%，若为真菌感染，其死亡率将更高[19]。相关研究发现晚发型败血症患儿的肠道菌群多样性明显降低，同时乳酸杆菌、双歧杆菌等益生菌明显减少[20]，表明肠道菌群的变化与晚发型败血症的发生存在潜在联系。本研究结果发现，与非脐静脉置管组相比，脐静脉置管组在第7 天变形菌门丰度显著升高，厚壁菌门丰度显著降低；同时潜在致病菌属，如克雷伯菌属丰度明显升高，而双歧杆菌、肠球菌属丰度明显下降，菌群构成较非脐静脉置管组发生明显变化。有研究表明粪肠球菌可提高肠道黏膜屏障完整性，与其他菌群一起调整微生态平衡，对病原体起到一定抑制作用[21-22]。而双歧杆菌作为一种益生菌，现广泛应用于临床，在维持肠道菌群平衡，提高机体免疫力和抗感染力以及控制内毒素等方面起着十分重要的作用[16]，是人体健康的主要守护菌群。结合本研究结果，考虑脐静脉置管可能降低菌群多样性，减少双歧杆菌及肠球菌的相对丰度，使潜在致病菌丰度升高，进而降低肠道对于病原体的抵抗力，增加败血症发 生率。

综上，本研究证实脐静脉置管可改变极低出生体质量儿的肠道菌群构成，降低菌群多样性，增加潜在致病菌属相对丰度而减少有益菌的丰度。然而，脐静脉置管是否增加喂养不耐受以及晚发型败血症等感染性疾病的风险，但仍需进一步研究证实。同时本研究也为对脐静脉置管的极低出生体质量儿出生早期补充益生菌提供了理论基础。既往研究表明益生菌的使用有助于预防坏死性小肠结肠炎、腹泻、喂养不耐受等疾病的发生，其作用机制为改善肠道黏膜屏障，调节免疫系统的动态平衡并防止肠道感染病原体或细菌移位[23]。但具体如何进行干预仍有待进一步探索。本研究存在一定不足之处，首先样本量较小，其次随访时间较短，未能远期监测患儿菌群变化及相关疾病的发生情况，仍需今后进一步开展大样本的 研究。