陆 艳，杨 义，张彦兵，魏建超，刘 珂，邵东华，李蓓蓓，马志永，邱亚峰

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

Notch信号通路作为一种进化过程中保守的信号通路，通过影响细胞的分化、增生、存活等在宿主发育中起着必要的作用[1]。在哺乳动物中，Notch信号通路由4个受体（Notch1、Notch2、Notch3和Notch4）以及5个配体（Jagged1、Jagged2、Dll1、Dll3和Dll4）构成。Notch信号通路为一种细胞间的信号通路，由不同细胞表面的受体和配体的相互作用而激活。具体为在配体与受体的细胞外区域结合后，胞内区（intracellular domain of Notch receptors,NICD）在蛋白酶（如γ-分泌酶）的作用下裂解，并释放入细胞核中；其中，在经典的Notch信号通路激活时，核内NCID与Notch信号通路的调控因子RBP-J结合，并招募相关的共激活蛋白（如CBP/p300等）调控下游靶基因（如Hey1等）的转录[2]。

Notch信号通路在免疫系统中也发挥着关键的作用，包括T淋巴细胞和B淋巴细胞的发育、T细胞功能调控、Th细胞的分化等。除淋巴细胞外，Notch信号通路影响DC细胞的调节作用以及巨噬细胞的激活[3-8]。有研究显示，TLR信号通路影响Notch信号通路中受体和配体的表达，继而通过Notch信号通路调控炎性因子的分泌以及巨噬细胞的激活[9]。由此可知，Notch-TLR相互协作促进TLR介导的巨噬细胞的激活以及炎性反应。

在人和小鼠上，Notch信号通路协同TLR调控炎性反应[3,10-11]。在猪源巨噬细胞上是否也存在Notch-TLR相互作用调控TLR诱导的炎性反应，目前还不清楚。本研究利用LPS处理猪肺泡巨噬细胞，分析LPS处理对Notch信号通路配体、受体以及下游靶基因表达的影响。此外，利用Notch信号通路抑制剂以及RBP-J基因沉默研究Notch信号通路对LPS诱导炎性反应的调控作用。本研究结果将为Notch信号通路在猪相关疾病中的作用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 主要试剂 OPTI-MEM、EDTA、RPMI 1640培养基、胎牛血清、细胞用PBS缓冲液均购自Gibco公司；抑制剂DAPT和LPS购自SIGMA公司；RNAiso PLUS（Trizol）、PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）、TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）均购自TaKaRa生物技术有限公司。Lipofectamine® RNAiMAX Reagent购自英潍捷基公司。

1.2 猪肺泡巨噬细胞的分离 实验用猪购自上海农科院猪场；猪肺泡巨噬细胞取自35～40日龄的健康仔猪，健康猪安乐死后，取出肺脏，用PBS缓冲液清洗后移入超净台，利用PBS（含EDTA）进行灌肺冲洗；4℃条件下将肺冲洗液300×g离心10 min，细胞利用RPMI 1640完全培养基重悬（含10%胎牛血清），计数后用于后续的实验。

1.3 DAPT抑制Notch信号通路 为了研究信号通路在LPS诱导的炎性反应中的作用，本实验选择DAPT（γ-分泌酶抑制）处理PAM抑制Notch信号通路。将新鲜制备的PAM细胞接种于24孔板，每孔1×106个细胞，过夜培养后，加入DAPT（终浓度为20 μmol/L），DMSO处理组为对照，预处理1 h后，加入LPS（1 μg/mL）或DMSO，继续培养6 h后收样。

1.4 RNA干扰 为了研究信号通路在LPS诱导的炎性反应中的作用，本研究采用RNA干扰沉默Notch信号通路调控因子RBP-J（siRNA序列见表1）抑制Notch信号通路的激活。按照上述的方法培养PAM，细胞贴壁后用1 μL RNAi MAX转染总体积为1.5 μL浓度为20 μmol/L的siRNA，于转染后66 h分别用LPS或DMSO处理，6 h后收样。

1.5 荧光定量PCR 根据Trizol Reagent的说明书，提取细胞的总RNA，利用PrimeScriptTMRT Master Mix试剂盒进行反转录，制备cDNA；随后，根据TB GreenTMPremix ExTaqTMⅡ的说明书配制荧光定量混合物，利用ABI 7500进行检测。以GAPDH为内标，计算percentage GAPDH的相对表达量（%GAPDH=100×2-ΔCT）以及差异倍数（Fold change=2-ΔΔCT）。所有统计学分析均使用t检验进行，P<0.05为差异显著，具有统计学意义，用“*”表示；P<0.01为差异极显著，具有统计学意义，用“**”表示。

2 结果

2.1 在PAM上，LPS处理激活Notch信号通路 已有研究显示，Notch信号通路参与调控LPS诱导的炎性反应[12-13]，其主要是LPS处理影响了Notch信号通路中一些受体或配体的表达，继而这些改变的受体或配体激活Notch信号通路，最终，影响炎性分子的表达。在PAM上，LPS处理是如何影响Notch信号通路中受体或配体表达的，还不清楚。因此，本研究首先在PAM上分析了LPS处理对Notch信号通路中受体或配体表达的影响。结果显示，LPS处理后在转录水平上显著增加配体Jagged1、Jagged2和Dll4的表达（图1A），但LPS处理不影响受体的表达（图1B）。为了检测LPS处理对Notch信号激活的影响，本研究对Notch信号通路的下游靶分子的表达情况进行了检测。结果显示，LPS处理后在转录水平上显著上调Notch信号通路下游靶基因Hey1的表达（图1C）。以上结果说明，LPS处理通过增加配体的表达激活Notch信号通路。

图1 Notch信号通路组分在猪肺泡巨噬细胞中的表达Fig.1 Expression of Notch signaling components in primary porcine alveolar macrophages

2.2 在PAM上，Notch信号通路抑制剂处理降低LPS诱导的炎性反应 在LPS处理激活Notch信号通路的研究基础上，我们继续分析了Notch信号通路在LPS诱导的炎性反应中的调控作用。首先，利用Notch信号通路的抑制剂DAPT（γ-分泌酶抑制剂）处理细胞，然后利用qPCR分析了炎性因子TNF-α和IL-1β的表达情况。结果显示，与DAPT未处理的对照组相比，DAPT显著地降低LPS诱导产生的TNF-α（图2A）和IL-1β（图2B）。此外，对Notch信号通路的下游靶基因进行检测，结果显示，在转录水平上DAPT处理抑制LPS诱导的Hey1的上调表达（图2C）。以上结果说明，Notch信号通路参与调控LPS诱导的炎性反应。

图2 DAPT抑制LPS诱导的炎症反应并抑制靶基因表达Fig.2 DAPT attenuats LPS induced inflammatory responses and inhibits target gene expression

2.3 在PAM上，沉默Notch信号通路转录调控因子RBP-J抑制LPS诱导的炎性反应 采用RNA干扰的方法沉默Notch信号通路转录调控因子RBP-J分析Notch信号通路在LPS诱导的炎性反应中的作用。结果显示，沉默RBP-J的表达（图3A）显著降低了LPS诱导产生的TNF-α（图3B）和IL-1β（图3C）。此外，在转录水平上沉默RBP-J抑制LPS诱导的Hey1的上调表达（图3D）。与DAPT处理的结果一致，Notch信号通路参与调控LPS诱导的炎性反应。

图3 干扰RBP-J可抑制LPS诱导的炎性反应并抑制靶基因表达Fig. 3 Interference with RBP-J inhibits inflammatory responses induced by LPS and inhibits target gene expression

3 讨论

本研究利用LPS/TLR4诱导炎性反应的模型初步揭示了在PAM上Notch-TLR通过协作调控促进炎性反应的机制，具体表现为：1）LPS/TLR4促进Notch信号通路的激活，包括在转录水平上调Jagged1、Jagged2、Dll4和靶基因Hey1的表达；2）Notch信号通路抑制剂DAPT抑制LPS诱导的炎性反应；3）沉默Notch信号通路转录调控因子RBP-J的表达抑制LPS诱导的炎性反应。本研究结果不仅揭示了在PAM上TLR促进Notch信号通路的激活，而且激活的Notch信号通路可进一步诱导TLR介导的炎性反应。

在人和小鼠巨噬细胞上的研究发现，LPS处理诱导不同Notch配体和受体的表达。在小鼠巨噬细胞上，LPS处理显著上调Jagged1的表达，但对其他配体或受体表达的影响因细胞不同而有所变化[13]。在BMDM上，LPS处理上调Dll4，但在人巨噬细胞上，LPS处理上调Jagged1和Dll1的表达对Dll4的表达没有影响[13]，而在RAW264.7细胞上，LPS处理并不影响Dll4的表达，反而促进Notch1的上调表达[12]。本研究结果显示，LPS处理增加了Jagged1、Jagged2和Dll4的上调表达，但不影响Notch受体的表达。因此，在不同的巨噬细胞上（人、小鼠和猪），LPS诱导都可上调Jagged1的表达，而其他配体或受体的变化因物种及细胞类型不同有所变化，Jagged1的上调表达对LPS诱导的炎性反应起着重要的作用[13-14]，但上调的Jagged1是否对LPS诱导的炎性反应起着重要的作用尚需进一步研究。

与对人或小鼠巨噬细胞上的研究结果类似，在PAM上，DAPT处理抑制LPS诱导的炎性反应。Notch信号通路存在经典或非经典的模式，本研究结果显示，沉默RBP-J（经典Notch信号通路调控因子）抑制LPS诱导的炎性反应。由此可知，在PAM上，LPS/TLR4通过经典的Notch通路调控炎性反应。

在兽医临床上，由多种病原微生物导致的猪呼吸道综合征（porcine respiratory disease complex,PRDC）给养猪业造成巨大的损失。其中，继发的细菌感染是导致PRDC的关键因素，其主要是通过诱导炎性因子的表达促进PRDC的产生[15-20]。本研究结果显示，Notch信号通路调控LPS诱导的炎性反应，不仅为揭示PRDC（由继发性细菌感染引起的）的致病机制奠定基础，也为将来PRDC疾病的防控提供重要的药物靶标。