吴 倩，张建华，郝永清

（内蒙古农业大学兽医学院 农业农村部动物疾病临床诊疗技术重点实验室，呼和浩特 010018）

牛传染性鼻气管炎（bovine infectious rhinotracheitis，IBR）是由牛传染性鼻气管炎病毒（Bovine infectious rhinotracheitis virus，IBRV）引起的接触性传染病，给我国的规模化养牛业带来严峻的考验。Liess等[1-2]报道IBRV第一次于联邦德国分离得到，并且由其引起的IBR在欧美牛群中广泛存在。一般讲，IBR分急性和慢性病例，病的后期往往难以分离出病毒。另外，慢性病例如有细菌性并发感染，易于诱发肺脓肿病。还有些病牛症状似牛恶性卡他热（bovine malignant catarrhal fever，BMC），其病原是牛疱疹病毒，这就需要用检测特异性抗体和分离病毒的方法来确诊[3-4]。IBRV是一种具有囊膜结构的双股DNA病毒，且以糖蛋白形式存在于囊膜表面或囊膜内。gE蛋白携带着某些蛋白质代谢去向信息，在细胞识别、信号传递中起着关键作用，同时gE糖蛋白还是非常重要的免疫原，在某些病毒粒子中可刺激机体产生中和抗体。gE基因是生物体内外复制的非必需糖蛋白，缺少该基因不会影响病毒在体内的复制能力。gE基因全长为1700 bp，共编码566个氨基酸[5-6]。本研究对牛传染性鼻气管炎病毒gE基因的原核表达产物为抗原建立了gE-ELISA检测方法，为进一步对牛传染性鼻气管炎的鉴别诊断和防控提供了重要技术支持[7]。

1 材料与方法

1.1 病毒、血清与载体 IBRV NMHS-1毒株、pCold-TF质粒由内蒙古农业大学兽医微生物实验室保存；IBRV标准牛阴性血清、阳性血清均购自中国兽药监察所。

1.2 菌种与试剂 E.coli Top10、E.coli Transetta（DE3）感受态细胞、Trans2000 DNA marker均购自北京全式金生物技术有限公司；DNA基因组提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；DNA胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒购自Axygen公司；Invitrogen Platinum SuperFi DNA聚合酶、限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自Thermo公司；HRP标记的兔抗牛IgG-HRP购自Abcam；Ni-IDA蛋白纯化试剂盒购自生工生物工程（上海）有限公司；显色液购自索莱宝生物公司。

1.3 引物设计与合成 根据DNAStar对IBRV gE基因序列（GenBank登录号：Query-227553）进行抗原区、亲水区及表面展示概率分析，并结合pCold-TF原核表达载体多克隆位点的序列，利用Primer Primier 5.0设计1对特异性引物，在引物的5'端加入Kpn I、EcoR I酶切位点。gE-F：5'-CGGGGTACCAT GACCCCGGGCTCGGCTTCGGT-3'，gE-R：5'-CCG GAATTCTTAATGGTGATGGTGATGATGGCTGGTT CCCTCTCCTCGT-3'。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。预期扩增片段长度为500 bp。

1.4 IBRV基因组的提取、PCR扩增 按照DNA试剂盒说明书提取IBRV病毒基因组DNA，以此为模板，PCR法扩增gE基因序列，反应条件为：95℃预变性4 min；95℃变性30 s，63℃退火30s，72℃延伸90s；72℃再延伸7 min。结束后取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，观察结果并进行胶回收。

1.5 重组表达质粒pCold-TF-gE的构建及鉴定 将胶回收纯化的目的片段与pCold-TF质粒用EcoR I、Kpn I于37℃双酶切2 h，取5 μL酶切产物电泳鉴定，并将目的片段与pCold-TF载体连接并转化Top10感受态细胞，挑取阳性菌落进行PCR及双酶切鉴定，经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，挑取阳性重组质粒送测序公司测序。

1.6 重组蛋白诱导表达、纯化 将阳性重组质粒转化到表达菌Transetta(DE3)，加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，37℃诱导6 h。收集上清液和沉淀，经12%分离胶进行SDS-PAGE电泳可溶性分析，然后用Ni-NTA亲和层析对重组蛋白进行纯化。并用SDS-PAGE电泳分析纯化效果，获得的重组蛋白命名为rpCold-TF-gE。

1.7 重组蛋白Western blot鉴定 将蛋白样品进行SDS-PAGE电泳后转移至硝酸纤维素膜上，用含有5%脱脂乳TBST溶液4℃条件封闭过夜。次日取出PVDF膜用TBST洗液洗涤5遍，用一抗稀释液稀释IBRV阳性血清（1∶100）作为一抗，恒温孵育1 h，用TBST洗液洗涤5遍后，加入HRP标记兔抗牛IgG（1∶3000）恒温孵育1 h，用TBST洗液洗涤5遍，最后用DAB显色液，曝光拍照。

1.8 重组蛋白rpCold-TF-gE标签的分离及纯化 将重组蛋白rpCold-TF-gE用HRV-3C蛋白酶切TF标签，得到单一的rgE蛋白，4℃酶切过夜，SDS-PAGE电泳分析酶切效果，纯化并回收目的片段，-20℃保存备用。

1.9 兔多克隆抗体血清制备、纯化及鉴定 取纯化蛋白rgE按1∶1比例加入弗氏完全佐剂，用磁力搅拌器乳化至呈油包水状态后，于臀部肌肉注射1只2.0 kg左右的大白兔，每次免疫间隔一周，共计免疫3次。于免疫后28 d心脏采血，间接ELISA法检测抗体效价，达到免疫要求后，离心收集上清液，-80℃分装保存备用。按照抗血清试剂盒说明书进行上清液纯化，取20 μL进行SDS-PAGE电泳检测。

1.10 rgE-ELISA最佳工作条件的确定

1.10.1 正交筛选法选择抗原和血清的工作浓度 用包被液将纯化的重组蛋白分别按照0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μg/mL包被96孔酶标板，每孔100 μL，一抗牛IBRV阳性血清和阴性血清分别按照1∶25、1∶50、1∶100、1∶200稀释。以兔抗牛IgG-HRP（1∶5000）为二抗，按照上述实验步骤，以10%BSA作为封闭液，确定最佳封闭条件及酶标二抗最佳工作浓度。每孔100 μL加入TMB显色液，室温放置10 min，然后加入50 μL 2 mmol/L H2SO4中止反应，在酶标检测仪上读出OD450值，根据P/N值确定最佳反应条件。

1.10.2 临界值确定 经上述条件的优化，取60份阴性血清，根据OD450值计算平均值（X）和标准偏差3SD，并确定ELISA待检阴性血清、阳性血清判定标准。

1.10.3 特异性试验 按照优化好的条件包被ELISA酶标板，分别对IBRV标准阴性血清、阳性血清、口蹄疫、牛病毒性腹泻、副结核、布氏杆菌、牛支原体等阳性血清进行gE-ELISA方法检测，判定其特异性。

1.10.4 敏感性试验 经过条件优化将IBRV阳性血清做1∶2梯度稀释，确定ELISA的敏感性。

1.10.5 重复性试验 按上述优化的条件，用同一批纯化抗原包被酶标板，并对5份IBRV阳性血清进行检测，每个血清设置5个重复，进行组内重复试验；同时采用不同批次的纯化抗原包被板，进行5次组间重复试验，通过公式计算变异系数。

1.10.6 临床样品的检测 采用建立的gE-ELISA方法对200份血清样品进行检测，同时用IDEXX (IBR)抗体检测试剂盒对200份血清样品进行检测，根据统计学分析计算两者的符合率。

2 结果

2.1 gE基因PCR扩增 以提取IBRV基因组为模板，经PCR扩增出gE基因后进行SDS-PAGE电泳鉴定，在500 bp处可见1条特异性条带，与预期的目的片段大小相符，结果见图1。

图1 gE基因PCR扩增结果Fig.1 Amplification results of gE gene PCR products

2.2 重组质粒的双酶切鉴定结果 重组质粒pCold-TF-gE用EcoR I、Kpn I双酶切后，经1%琼脂糖凝胶电泳检测。结果可见1条约为500 bp的目的条带，与预期结果相符。见图2。

图2 重组质粒双酶切鉴定Fig.2 Double enzyme digestion of recombinant plasmids

2.3 重组蛋白的诱导表达及纯化鉴定 收集诱导表达产物，通过超声波破碎仪裂解重组菌体，离心后分别取上清液和沉淀进行SDS-PAGE电泳检测，上清液和包涵体在70 kDa处均出现融合性目的条带，而pCold-TF空载体诱导后无特异条带（图3）。使用Ni-IDA蛋白纯化试剂盒纯化表达产物上清液，获得可融性目的条带，分子量约为70 kDa，与预期结果相符，表明诱导表达成功，获得的重组蛋白命名为rpCold-TF-gE，见图4。

图3 IPTG诱导表达的SDS-PAGE鉴定重组蛋白rpCold-TF-gEFig.3 SDS-PAGE identification recombinant protein rgE IPTG induced expression

图4 纯化后的重组蛋白rpCold-TF-gE SDS-PAGE鉴定Fig.4 SDS-PAGE identification of purified recombinant protein rpCold-TF-gE

2.4 重组蛋白Western blot检测 rpCold-TF-gE重组蛋白纯化后经Western blot分析，结果显示，在70 kDa位置出现阳性条带，说明重组蛋白rpCold-TF-gE在大肠杆菌中获得正确表达并且能被IBRV阳性血清特异性识别，表明表达的重组蛋白具有很好的反应原性（图5）。

图5 纯化后的重组蛋白rpCold-TF-gE Western blot 鉴定Fig. 5 Western blot identification of purified recombinant protein rpCold-TF-gE

2.5 rgE重组蛋白标签的分离及纯化 由于rpCold-TF-gE融合蛋白标签 TF（54 kDa 左右）相对目的蛋白（14 kDa左右）较大，用蛋白酶纯化试剂盒将TF蛋白与gE蛋白分开，并纯化得到无TF标签的重组目的蛋白rgE（14 kDa)，SDS-PAGE 电泳分析可见，有单一的目的蛋白出现，分子量大小为14 kDa（图6）。

图6 重组蛋白rpCold-TF-gE标签的分离及纯化Fig.6 Separation and purification of recombinant protein label

2.6 兔多克隆抗体血清效价、纯化及鉴定 抗血清效价测定，通过IBRV全病毒蛋白以2 μg/mL的包被量建立间接ELISA方法对多克隆抗体血清效价进行检测。结果显示：家兔的血清抗体效价均能达到2.0×1011；用血清纯化试剂盒纯化多克隆抗体血清，获得了较高纯度的兔多克隆抗体血清，其中lgG分子结构重链为55 kDa，轻链为25 kDa（图7）。

图7 SDS-PAGE 鉴定兔多克隆抗体血清Fig. 7 Identification of rabbit polyclonal antiserum by SDS-PAGE

2.7 gE-ELISA工作条件的确定

2.7.1 一抗稀释度及抗原包被量的确定 方阵实验结果表明，当抗原包被最佳稀释倍数为1∶1000即浓度为1 μg/mL，待检血清以1∶50稀释时，P/N值最大，结合阴阳性血清OD450值，确定抗原最佳包被浓度为1 μg/mL，一抗血清最佳稀释度为1∶50。

2.7.2 ELISA 阴阳性临界值的确定 通过以上条件的优化，对60份阴性血清经IDEXX (IBR) 抗体检测试剂盒检测，其OD450值为0.255，则临界值为0.038，即当样本OD450＞X＋3SD时判为阳性，反之为阴性。

2.7.3 特异性试验结果 按照上述优化条件，分别对口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒、副结核分歧杆菌、布鲁菌、支原体等牛阳性血清进行gE-ELISA检测，同时设IBRV标准阳性、阴性对照。结果显示为阴性，表明建立的 ELISA 方法特异性较好，结果见表1。

表1 特异性试验结果Table 1 Results of specific test

2.7.4 敏感性试验结果 将IBRV阳性血清做1∶2梯度稀释，将血清稀释至1∶4096时仍可判断为阳性，表明建立的方法具有较高的敏感性，结果见图8。

图8 敏感性试验结果Fig.8 Sensitivity test results

2.7.5 重复性试验结果 对5份牛IBRV阳性血清进行间接ELISA 检测，组内和组间重复试验结果显示，组内、组间的变异系数均小于5%，表明该方法具有较好的重复性。

2.7.6 临床样品检测结果 利用建立好的gE-ELISA方法对200份临床血清样品进行检测，结果显示，gEELISA方法检出阳性血清170份、阴性血清31份；利用IDEXX（IBR）抗体检测试剂盒对200份临床血清样品进行检测，结果检出阳性血清 180份，阴性血清20份，共同检出阳性血清170份，阴性血清20份，两种方法的符合率为95%。

3 讨论

IBRV的gE糖蛋白与其他牛疱疹病毒gE糖蛋白比较可知，组成的二硫键5个半光氨基酸碱基骨架高度保守且免疫原性和抗原性较高。在生物功能方面，gE蛋白作为中和抗体的主要靶位，能刺激机体产生抗体，并且可高水平表达，适合作为抗原标记[8]。

目前我国各地牛场中牛IBRV血清感染率普遍较高。在鉴别诊断上有疫苗和酶联免疫吸附试验，有研究发现关于gE基因缺失疫苗，可区分自然感染牛和疫苗免疫牛，同时能够有效地保护牛从而使本病的发生概率降到最低，此疫苗主要针对gK、TK、gE基因等进行缺失，目前国内并无该基因缺失疫苗上市使用[9-10]。酶联免疫吸附试验较传统疫苗和基因缺失疫苗成本低廉而且可以大批量的检测临床血清，特异性好，敏感性强，为IBRV检测试剂盒的研发奠定了基础。

表2 重复性试验结果Table 2 Reproducibility test results

牛传染性鼻气管炎的防控技术首先是灵敏高特异性强。利用全菌蛋白包被板建立的ELISA较易出现假阳性结果和与其他血清出现交叉反应。本研究根据跨膜结构域分析、蛋白抗原性、亲水性、表面性分析，选择建立以gE基因原核表达产物为抗原，用标准阳性血清为一抗，并用HRP标记的兔抗牛IgG为二抗的gE-ELISA检测方法。血清稀释1∶4096时仍可判断为阳性，表明该方法有较高的敏感性。该方法只对牛阳性血清有反应，与其他血清无反应，表明该方法特异性强。较PCR检测方法，该方法成本低廉检测样本量大。通过对临床血清样品进行初步检测，与IDEXX（IBR）抗体检测试剂盒相比，本研究建立的方法孵育时间较长，有待进一步的改善，以期达到治疗和控制该病的发生并减少经济损失[11]。

本研究在国内首次以gE基因原核表达产物为抗原建立gE-ELISA检测方法，可用于牛传染性鼻气管炎病毒血清抗体的检测。本研究制备的兔多克隆抗体血清为后续的双抗夹心法检测抗原提供了可靠的方法和技术支持。本研究建立的方法适合大规模高通量的检测，对自然感染及鉴别诊断和进出国际贸易检疫工作具有积极意义[12]。