李海燕，李红梅，魏蔚，吴洋，王孟瑜，俞德帅，王显

心血管疾病是影响人类健康疾病的首要重大因素，其死亡率呈不断上升趋势，最常见为冠状动脉（冠脉）粥样硬化性疾病。随着对冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）的不断研究与探索，冠脉微血管疾病的研究已成为冠心病防治的热点，经皮冠脉介入治疗（PCI）后微小栓子脱落造成微循环障碍的主要因素，此病理过程同本团队提出的络风内动病机相似，尤以缺血性络风内动证为主，但目前尚未具有成熟模型对其进行深入研究，因此通过向大鼠冠脉注入同种异体血栓微颗粒及可以导致内皮功能损伤的月桂酸钠混合剂高度模拟冠脉微栓塞形成过程初步建立缺血性络风内动证动物模型[1-5]。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级（SPF）雄性SD大鼠，体重（260±20）g，由北京维通利华动物实验中心提供[生产许可证编号：SCXK(京)2016-0006]，分笼饲养于北京中医药大学东直门医院中医内科重点实验室清洁级动物房，恒温环境，标准饮食，自由饮水。

1.2 试剂及仪器 月桂酸钠（货号L9755-5G，Sigma公司）；大鼠心肌肌钙蛋白I（cTnI）试剂盒（批号：ka4341，Abnova公司）；大鼠血管假血友病因子（vWF）试剂盒（批号：mb-1962-a-a，北京赛谱锐思公司）；水合氯醛（上海沪试实验器材公司）；4%多聚甲醛（北京绿源科技 novon）；盐酸利多卡因注射液（中国大冢制药有限公司）；40 U一次性胰岛素注射器（美国BD公司）；玻璃分针（北京玻璃厂）；小动物呼吸机（型号：ALC-V8，上海奥尔科特生物有限公司）；生物光学显微镜（型号：BX60，OLYMPUS）；计算机辅助图像分析系统（版本：SPOT 4.6，美国Diagnostic Instruments）；全自动酶标仪（型号：MK3，Thermo公司）；高速离心机（型号：TGL-1，上海安亭科学仪）；电子分析天平（型号：AR2140，上海奥豪斯生产）。

1.3 实验分组 将72只体重（260±20）g的SD大鼠采用随机数字表法先取出2只制备同种异体血栓，其余70只再同理随机分为假手术组30只和模型组40只，实验组动物分别于术后1h、术后3 h、术后1 d、术后3 d和术后1周处死，各时间点保证每组5只大鼠存活。

1.3.1 同种异体血栓制备 将已配置好的10%水合氯醛按0.35 ml/100 g腹腔麻醉后进行腹主动脉取血，静置成固块后于37℃恒温箱中过夜。24 h后将干燥的血凝块充分研磨后，38 μm孔筛过筛后分装备用，确保颗粒大小均一。

1.3.2 开胸注入混合悬液制备模型 大鼠水合氯醛麻醉后行术区备皮，经口腔行无创气管插管术，确认气管位置后连接呼吸机辅助通气，参数为潮气量6 ml，吸呼比1：2，呼吸频率为70 次/min，保证呼吸道通畅；沿大鼠右侧胸骨第2~3肋间开胸，逐层剥离筋膜、肌肉层，暴露主动脉根部，玻璃分针分离主动脉根部周围组织，穿过丝线使其充分暴露后用小动脉夹钳夹升主动脉，助手稳定血管的同时，术者将配制好的0.75 mg/ml月桂酸钠溶液0.2 ml（用去离子水配）+2.5 mg血栓颗粒混悬液用套有保护装置的40 U胰岛素注射器迅速垂直刺入血管并注射悬液，假手术组给予0.2 ml去离子水，总耗时大约5~8 s，注射完毕迅速拔出注射器及撤出动脉夹，同时棉球压迫止血，未见出血，心率稳定后，采用8字缝合法逐层关胸缝合，术后予0.1 ml利多卡因皮下注射防恶性心律失常，普通饮食水，连续3 d给予40万U青霉素腹腔注射，预防感染，分别于术后相应时间点取材。

1.3.3 模型评价 ①中医证候评价：参照《胸痹心痛络风内动证诊断专家共识》标准，结合缺血性络风内动病机特点及动物自身特点，有络虚、血瘀及风动表现者作为考虑；②病理组织评价：以大鼠心肌相应时间点微血管内出现微血栓或血管周围出现微梗死灶为宜，作为最佳评判模型成功标准。

1.4 观察指标及方法

1.4.1 一般情况 实验过程对大鼠体重、精神状态、活动情况、舌色、毛发及爪甲耳廓颜色进行动态观察并记录。

1.4.2 vWF、c TnI检测 分别于术后1 h、术后3 h、术后1 d、术后3 d和术后1周时，大鼠麻醉后腹主静脉取血2 ml贴壁注入含有0.109 mol/L枸橼酸钠抗凝采血管中，静置后高速离心机3000转/min离心10 min，用移液枪吸取上清液分装于1.5 ml EP管中，做好标记，放置于-20℃冰箱保存，采用全自动酶标仪进行ELISA法检测。

1.4.3 病理组织检测 分别于术后相应5个时间点麻醉大鼠后，10%氯化钾注射液2 ml快速推入腹主静脉，使心脏停搏于舒张期。迅速开胸摘除心脏，生理盐水冲洗后剪去心耳，生理盐水恒压灌流约直液体清亮后更换为4%多聚甲醛溶液继续灌注，灌流结束后沿心脏最大横径垂直将心脏平均切成3段，厚度约3 mm，固定于4%多聚甲醛中24 h后脱水、石蜡包埋、切片、染色，光学显微镜观察组织栓塞血管数量、血管损伤情况、炎细胞浸润及微梗死情况，借助图像分析软件计算微梗死面积占视野面积百分比。

1.5 统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行数据分析。计量数据资料以均数±标准差（±s）表示。多组使用单因素方差分析（ANOVA），方差齐时可使用LSD检验，方差不齐则使用welch方法进行对比分析。P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组间大鼠的一般情况 术后两组大鼠术后初期精神状态及活动均较差，假手术组术后1周时精神活动接近术前；与假手术组相比，模型组喜欢蜷缩、眯眼，术后1周时模型组仍状态稍差，个别大鼠舌像可见舌质紫暗，舌下脉络瘀紫；爪甲及耳廓颜色两组之间初期未见明显异常，术后1周时模型组颜色略淡于假手术组。术前模型组和假手术组体重间对比差异无统计学意义，术后3 d时模型组体重下降多，但下降幅度对比差异无统计学意义（P＞0.05），术后1周时，模型组较假手术组体重增长慢，但增长数值间差异无统计学意义（P＞0.05）。实验开始至术后1周，模型组死亡率为30%，假手术死亡率为6.7%，总体死亡率为20%。模型组成模率为80%。

表1 实验大鼠术前及术后体重变化

2.2 各组间vWF水平比较 相同时间点：与假手术组相比：模型组术后1 h至术后3 d vWF浓度均低于假手术组，1周时高于假手术组；模型组术后1 d和术后3 d时，vWF水平均明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05），余时间点之间对比差异无统计学意义（P＞0.05）。不同时间点：①模型组之间：模型组中术后1 h至术后3 d时，vWF浓度呈逐渐降低趋势，术后1周时较前略增高，组间两两比较差异无统计学意义（P＞0.05）；②假手组各组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 各组之间cTnI水平比较 相同时间点：与假手术组对比，各时间点模型组cTnI浓度均高于假手术组，术后1 h和术后1 d浓度较假手术组差异有统计学意义（P＜0.05），其余时间点之间差异无统计学意义（P＞0.05）。不同时间点：①模型组间：与模型组术后1 h对比，其他时间点cTnI浓度均明显低于术后1 h组，差异有统计学意义（P＜0.05）。②假手术组间：各组间对比差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.4 各组大鼠病理组织表现 ①微血管内血栓形成（表4）：假手术组在各个时间段均未见明显微血栓形成，模型组在术后1 h和3 h间均可见到微血管内血栓形成，1 h数量多于3 h，差异有统计学意义（P＜0.05），术后1 d、3 d、1周时均未看到明显微血栓形成；②微血管损伤、炎细胞浸润：假手术组未见，模型组在术后3 h可见微血管内皮受损及炎细胞浸润，持续至术后1周时仍可见，炎细胞浸润随时间逐渐加重；③心肌微梗死（表5）：假手术组各时间点未见梗死灶，模型组大鼠：术后3 d时可见多处以微血管周围为主要表现的心肌组织坏死，伴炎症反应，术后1周时梗死仍存在，可见大量炎细胞，梗死面积所占视野百分比较术后3 d时减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

构建缺血性络风内动证动物模型是在大鼠冠脉微栓塞模型基础上进行，本团队认为缺血性络风内动证的主要病理因素为“络结”和“络弛”，“络结”指络脉管壁由于痰浊、瘀血、瘀脂等原因所致增厚、变硬、凹凸，影响络脉正常的气血流通而产生的一种病理状态[6]。“络弛”则是络脉因某种原因导致络脉麻痹弛缓，血液滞留于局部而他处血少或无血，影响络脉渗灌、返注的一种病理状态。此病理生理过程引起内皮损伤导致冠脉粥样斑块破裂、PCI后和溶栓疗法后血栓脱落等导致远端微小血管阻塞过程较为相似，而临床中由微小血管阻塞导致胸痛症状的患者，在具有心肌缺血症状冠脉造影显示非阻塞性病变的患者中，其发生率约45%~60%，具有较高的研究价值。

目前关于冠脉微栓塞动物水平造模方法主要包括冠脉微栓塞剂法、自体血栓栓塞法及化学损伤法。其中冠脉微栓塞球法实验所选用的微栓塞制剂为外源性物质，不具有生物活性，实验多通过介入方法，成本较高。自体血栓栓塞法栓塞剂为自体微血栓，富含丰富纤维素、血细胞、血小板等成分，但自体血栓通常成为非原位血栓，不以内皮损伤为始动过程，与正常生理病理过程不完全相符；化学损伤法通过月桂酸钠造成微血管内皮损伤，脱落、穿孔，使血管完整性受损，诱发血小板黏附、聚集，最终导致原位微血栓的形成，但难以模拟破裂斑块造成的弥漫性微栓塞过程[7,8]。以往实验多采用自体血栓制备，每只大鼠均采用尾静脉取血，操作较为繁复，本实验采用同种异体血栓可以既能保证栓子的生物活性，又可减少自体血栓制备的繁复程度[9]，其与月桂酸钠混合液同时注入，不但可模拟其血管内皮损伤的情况，又可模拟栓子脱落到远端的过程，且能在较短时间内构建模型。

表2 实验大鼠血浆血管假血友病因子浓度（ng/ml）

表3 实验大鼠血浆肌钙蛋白I（ng/l）

表4 不同时间点模型组和假手术组血栓形成数量（个）

表5 不同时间点假手术组和模型组微梗死情况（ ±s，%）

表5 不同时间点假手术组和模型组微梗死情况（ ±s，%）

注：与术后3 d比较，a P＜0.05

组别 样本数 术后3 d 术后1周假手术组 3 0 0模型组 3 22.24±16.99 10.92±6.68a P值 — 0.000 0.000

本实验中血栓颗粒大小和月桂酸钠溶液浓度比通过预实验摸索出的最佳结果为2.5 mg/ml和0.75 mg/ml混合0.2 ml悬液，但在预实验探索过程中，发现在高浓度月桂酸钠溶液可使血栓颗粒部分溶解，削弱一部分血栓微颗粒作用，月桂酸钠自身也有可以损伤血管造成血栓形成的作用，作用机理仍需进一步探究。

本研究中，大鼠血浆中cTnI水平：模型组术后均高于假手术组，且术后1 h最高，之后降低并维持一定水平，接近假手术组浓度，考虑术后1 h就可能出现微血管损伤，同时心肌损伤也可能伴随出现，即形态学未见明显变化，但在功能学方面改变相对出现较早，此过程同PCI中血管再通时由于栓子脱落导致急性心肌损伤病理过程相同，是高度模拟了PCI后栓子脱落导致微栓塞过程的体现。血浆中vWF水平：由于vWF作为胶原纤维和血小板的中介参与凝血过程，术后1 h和术后3 h凝血过程启动血栓形成明显，可检测血浆vWF减少。当凝血过程中消耗vWF增多时，机体代偿性增加vWF的分泌，但初期不足以弥补vWF减少的含量，故在术后1 d、3 d时未见明显血栓形成的情况下总量依然是低于正常水平，仍然呈下降趋势。随着凝血和抗凝动态平衡稳定后，血栓形成减少甚至消失，血浆中vWF消耗减少，代偿性的vWF增多，故在术后1周时可见vWF逐渐恢复正常甚至会略超过正常水平，此后可能会恢复到正常水平，可进一步延长观察周期动态关注其变化过程。

病理学动态变化：①术后1 h即出现微栓塞的表现，持续至术后3 h仍可见，推测微血栓形成可能出现在更早的时间段，其中术后3 h可见有血管壁损伤时候表现为血栓数量较前下降，考虑开始时既有微栓塞注入到微血管形成的外来血栓，又有血管内皮受损激活凝血系统产生的原位微血栓，此时内皮损伤不明显，因此未见明显血管壁完整性破坏表现。随着血栓数量增多，机体为维持凝血系统动态平衡将继发性引起纤溶亢进，纤溶酶原激活物增多，水解纤溶酶原为纤溶酶，降解纤维蛋白原，参与抗凝过程，一部分自身产生的原位血栓被水解，但原有的微栓子虽有一定活性但由于制备工序等与自身新鲜的原位血栓仍有区别，不能被迅速降解，因此术后3 h仍有少量血栓存在，术后1 d时未见明显血栓颗粒也可作为上述现象理由之一。因此，如何鉴定是血栓微颗粒栓塞产生的血栓还是由月桂酸钠损伤内皮产生的原位血栓可以为我们提供新的思路，作为进一步研究的对象，可采用特异性标记的方式或者其他有效方法区分；②术后3 h后开始看到明显血管壁中断表现，心肌可见炎性细胞浸润，以心外膜较为明显，而术后1 d时未看到明显血栓形成，但仍有炎细胞浸润和受损的血管壁，提示机体损伤仍然存在；③术后3 d时机体开始有修复的表现，其抗损伤功能体现出明显的作用，由于心肌再生能力微弱，故表现纤维组织和血管的再生，部分心肌可见多处小灶性梗死；术后1周时炎细胞数量较3 d时减少，以纤维母细胞为主，大量淋巴细胞，巨噬细胞，伴有少量中性粒细胞，梗死区域可见大量新生毛细血管，数量较术后3 d时增多。组织修复能力进一步提高。由于梗死区毛细血管大量增生，使得梗死区缺血情况得以改善，故一定时间内代偿后，可挽救心肌免于坏死、液化出现室壁瘤等严重表现。

中医证候评价：根据缺血性络风内动病机表现特点，其必备条件为络虚和血瘀：①络虚：络虚通常为络气虚，可表现为年老体弱，血脉弛缓，与冠脉微栓塞长期内皮功能障碍导致血管粥样硬化的病理基础较为相似，本模型通过损伤内皮，模拟了气血不和、络气亏损状态，术后大鼠活动缓慢，精神迟钝，眯眼频繁，耳廓、爪甲与舌象可见色淡苔白等症状均为络虚的表现；②血瘀：在本实验中，我们制备的同种异体血栓颗粒可高度模拟“瘀血”病理产物，同时在药剂注入后在内皮损伤的基础上加上血栓微颗粒弥漫性阻塞脉管微循环，模拟瘀血阻络病机导致气虚血瘀的过程。术后1周时，模型组大鼠舌质暗红伴有瘀血等症状亦是血瘀的表现；③动风征象：术中大鼠开胸，宗气外泄，撕破心包，心元大伤，药剂注入后导致发病急骤，病情变化多端，可通过小血管内血栓快速形成、心肌损伤标志物升高、假血友病因子迅速减低体现，且病理动态演变过程是其变化的最佳证据，充分体现了“风”的特点。

综上，本模型具有缺血性络风内动证的特点，可作为初步药物干预研究基础模型，为络风内动病机理论学术提供新的科学研究平台。