王红，姜涛，石云霄

急性心肌梗死（心梗）是常见的动脉粥样硬化性心血管疾病，其主要发生机制为冠状动脉（冠脉）粥样硬化导致新生血栓，引起血管急性闭塞，导致心肌持续性缺血造成心肌急性坏死[1]。急性心梗在临床上十分常见，已成为威胁人类生命的杀手。有研究报道，炎症反应是促发动脉粥样硬化血管血栓破裂的主要原因[2]。急性心梗后患者出现左室重构，会导致心肌收缩功能降低，影响预后。微小RNA（microRNA）已成为心血管疾病中的研究热点，在与心脏组织有关的多种疾病中（例心梗、肥厚性心肌病、心力衰竭等）均发挥了重要的调节作用[3]。Yu等[4]发现miR-143表达增加可通过减少炎症反应来减轻心肌肥大。原平等[5]发现急性心梗时，平滑肌细胞大量调亡，miR-143通过抑制细胞增殖从而促进平滑肌细胞分化。Liu等[6]发现环氧化酶2（COX-2）是miR-143的下游基因，COX-2在心肌梗死患者心肌细胞中异常表达。龙作鹏[7]研究发现COX-2与血管平滑肌细胞的功能有关，同时能诱导细胞炎性因子生成，促进急性心肌梗死疾病的病情进展。本研究拟探讨miR-143、COX-2的表达情况，旨为明确其在急性心梗发展中的作用及对心血管事件发生的预判。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2018年6月至2019年6月于开封市中医院收治的急性心肌梗死患者93例为研究对象，年龄30~82岁，均经心电图显示为ST段抬高型心肌梗死，合并高血压41例，糖尿病45例，纳入标准：符合《急性心肌梗死诊断和治疗指南》2015修订版中诊断标准[8]。患者均有缺血性胸痛临床病史且发作持续时间≥30 min并接受随访。排除标准：入院前接受抗炎药物治疗患者；患有恶性肿瘤、严重肝、肾功能异常患者；患有自身免疫性疾病患者；无法手术者。另选择同期健康体检者100例为对照组，年龄32~85岁。本研究经受试者及家属知情同意，签署知情同意书，并经伦理委员会批准。两组患者在性别、年龄、体质指数（BMI）及合并基础疾病等方面差异无统计学意义（P＞0.05）。心梗组血清总胆固醇、低密度脂蛋白高于对照组（P＜0.05），表1。

1.2 试剂与仪器 COX-2 ELISA试剂盒（货号：JKSJ-2202），购自上海晶抗生物工程有限公司；RNA SYBR Green PCR Kit（货号：KL101-969），购自上海康朗生物科技有限公司；RNA提取试剂盒（货号：R1200-100），购自北京索莱宝科技有限公司；SYBR® Green Quantitative RT-qPCR Kit（货号：QR0100），PrimeScript RT reagent Kit（RR047A）购自日本Takara 公司；CFX96 qRT-PCR仪购于德国Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 样本采集 所有研究对象清晨空腹时采取静脉血5 ml，静置20 min 4℃，3000 r/min，离心10 min，留取上清液装于无RNA酶的EP管中，于-80℃冰箱中待测。

1.3.2 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测血清中miR-143的水平 将样本从冰箱中取出，在超净工台上自然溶解，用无RNA酶试剂提取血清中总RNA进行检测，若OD260/OD280约1.8~2.0，表明RNA未被蛋白质或苯酚污染，可用于后续试验操作，依据反转录试剂盒操作步骤反转录得到cDNA。采用CFX96 qRT-PCR仪对miR-143及内参U6进行扩增反应。miR-143正向引物5’-GTCGT ATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGA TACGACGAGCTACA-3’，反向引物’-GTTCGT GGGTGAGATGAAGCACTG -3’；内参U6正向引物5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’，反向引物5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’。引物由上海生工合成。q RT-PCR反应体系20 μl：5×SYBR Green qPCR Mix 4 μl，上下游引物各2 μl，cDNA模板2 μl，ROX Reference Dye 0.4 μl，ddH2O 9.6 μl。反应条件：95℃，3 min；95℃，30 s；57℃，30 s；72℃，1min；30个循环；72℃，5min。对miR-143相对表达量用2-△△CT法计算。采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定血清COX-2水平，试剂盒采用COX-2 ELISA试剂盒。

1.4 随访 对急性心肌梗死患者随访6个月，统计6个月内发生不良心血管事件情况，包括死亡、再次心肌梗死、严重心律失常和心力衰竭等。

1.5 统计学分析 采用软件SPSS 22.0对数据进行分析，计数资料用n（%）表示，采用χ2检验。计量资料以平均值±标准差（±s）表示，多组比较行单因素方差分析，组内两组间均数相比行snk-q检验，采用Pearson法分析miR-143水平与COX-2水平的相关性，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者血清miR-143、COX-2水平 与对照组相比，心梗组患者血清miR-143水平较低，COX-2水平较高（P＜0.05），表2。

2.2 心梗组血清miR-143和COX-2水平与术后心血管事件发生率的关系 按照miR-143平均水平将心梗组分为miR-143高水平组（39例）和miR-143低水平组（54例）。miR-143低水平组发生心血管事件发生率为31.48%（死亡4例，再次心肌梗死4例，严重心律失常5例，心力衰竭4例）；miR-143高水平组发生心血管事件发生率为12.82%（再次心肌梗死1例，严重心律失常3例，心力衰竭1例）。miR-143低水平组心血管事件发生率明显高于miR-143高水平组，差异有统计学意义（χ2=4.366，P＜0.05）。按照COX-2平均水平将心梗组分为COX-2高水平组（51例）和COX-2低水平组（42例）。随访发现，COX-2高水平组发生心血管事件发生率为31.37%（死亡4例，再次心肌梗死3例，严重心律失常6例，心力衰竭3例）；COX-2低水平组发生心血管事件发生率为11.91%（再次心肌梗死2例，严重心律失常2例，心力衰竭1例）。COX-2高水平组心血管事件发生率明显高于COX-2低水平组，差异有统计学意义（χ2=4.993，P＜0.05）。

表1 一般资料比较

表2 两组患者血清miR-143、COX-2水平比较（±s）

表2 两组患者血清miR-143、COX-2水平比较（±s）

注：COX-2：环氧化酶2

组别 例数 miR-143/U6 COX-2（U/L）心梗组 93 0.74±0.21 62.37±14.95对照组 100 1.06±0.33 22.59±6.64 t值 - 7.970 24.158 P值 - 0.000 0.000

2.3 心梗组血清miR-143与COX-2相关性分析 Mirtarbase网站预测，miR-143与COX-2存在结合位点（图1）。Pearson相关性分析显示，心梗组患者血清miR-143水平与COX-2水平呈负相关（r=-0.734，P＜0.05），图2。

2.4 影响心血管事件的危险因素分析 多因素Cox比例风险分析表明，miR-143低水平、COX-2高水平是急性心梗患者预后不良的独立危险因素（HR=1.952，95%CI：1.227~3.106；HR=2.291，95%CI：1.304~4.026，P＜0.05），表3。

图1 miR-143与COX-2结合位点

图2 心梗组患者血清miR-143水平与COX-2水平的相关性

表3 影响急性心肌梗死患者心血管事件发生的危险因素分析结果

3 讨论

急性心梗有较高的致死率，其发病机制与血管平滑肌细胞调亡、促炎症反应增加、心脏纤维化相关[9]。早发现、早治疗对改善预后非常重要。

急性心梗临床特征为心肌细胞调亡和炎症反应加重[10]。microRNA是内源性非编码RNA，可通过抑制mRNA转录或降解mRNA方式在转录及转录后水平调控基因表达，从而影响细胞增殖、分化和调亡。研究报道[11,12]microRNA在转录及转录后，参与许多重要病理过程。也有研究显示[13]microRNA可通过调节巨噬细胞、平滑肌细胞的多种功能参与心血管疾病的发病过程。心血管疾病的发生与心血管细胞的增殖、迁移和分化及血管生成有密切联系，例miR-143通过对血管紧张素的调节可扩张血管、抑制血管纤维化[14]。朱启娥等[15]研究发现外泌体携带的miR-143在心血管疾病中呈高表达。文献显示[16]血管平滑肌细胞是动脉血管壁的主要类型，是多种心血管疾病的病理基础，miR-143可调节血管平滑肌细胞的增值。Liu等[6]研究发现在心梗患者的心肌细胞中，miR-143表达水平下降，促进心肌细胞调亡。郝理等[17]研究发现人冠状动脉粥样硬化组织中miR-143水平明显低于正常组织，但miR-143无法抑制疾病的进展。本研究发现心梗组患者血清中miR-143水平显著高于健康体检者，提示miR-143可能与急性心肌梗死的发生有关，miR-143可作为急性心肌梗死的潜在生物标记物。

COX有2种亚型，COX-2是受某种刺激产生的诱导性酶。研究报道[18]，COX-2含量与大鼠急性心梗部位细胞凋亡的严重程度呈正相关，且COX-2表达增加会促进缺氧/复氧大鼠心肌细胞的调亡。Ma等[19]发现COX-2蛋白在大鼠心肌缺血期间心脏组织中高表达的蛋白质，且COX-2被证明与心肌梗死中细胞凋亡的严重程度有关。Zhang等[20]研究发现COX-2的过表达可促进心肌细胞的调亡，而牛蒡子苷元可通过抑制COX-2高表达而发挥抗心梗的保护作用。赖永坤等[21]研究发现，急性心梗患者血清中COX-2水平明显高于健康体检者，COX-2可能成为治疗冠脉综合征的潜在靶位点。本研究发现COX-2在心梗组患者血清中水平显著高于健康体检者，提示COX-2可能在急性心梗的发生中起到重要作用。Liu等[6]研究发现在心梗患者心肌细胞中COX-2是miR-143下游靶基因，且二者在心肌细胞中呈负相关。本研究通过miRtarbase网站预测，miR-143与COX-2存在结合位点，且Pearson分析显示心梗组患者血清miR-143水平与COX-2水平呈负相关，提示miR-143可能与COX-2共同影响急性心梗疾病发生，二者可能存在调控作用。本研究进一步分析发现，miR-143低水平组心血管事件发生率明显高于miR-143高水平组，COX-2高水平组心血管事件发生率明显高于COX-2低水平组，提示miR-143与COX-2可能与急性心梗患者术后心血管事件的发生有关，miR-143异常低表达以及COX-2异常高表达均不利于患者预后。Cox比例风险分析表明，miR-143低水平、COX-2高水平是急性心梗患者心血管事件发生的独立危险因素，提示miR-143与COX-2可能对预判急性心梗患者心血管事件情况具有参考价值。

综上所述，急性心梗患者血清中miR-143水平下调，COX-2水平上调，miR-143、COX-2为急性心梗后心血管事件的发生评估提供理论参考[22]。但miR-143如何在急性心肌梗死中调控COX-2还需进一步扩大样本量深入探讨。