丁珍,于菲,万经红

(淄博市中医医院儿科,山东 淄博 255300)

支气管哮喘(简称哮喘)是以慢性气道炎症和气道高反应性为特征的异质性疾病。哮喘慢性气道炎症最终导致气道的持续性损伤而致气道结构异常，即气道重塑。气道重塑是哮喘的重要病理特征，显著影响哮喘的预后。哮喘的发生发展与遗传因素和环境因素有关，其中哮喘易感基因发挥重要作用。血清类黏蛋白1样蛋白3(ORMDL3)基因是一种哮喘关联基因，与哮喘气道重塑的发生、发展密切相关[1]。吸入布地奈德可以减少ORMDL3表达，并减轻气道重塑的严重程度，二者有明显相关性[2]。然而，长期大剂量使用糖皮质激素会产生较大副作用，诱发或加重感染，抑制机体的免疫功能[3-4]。川芎嗪为中药川芎主要有效成分，是一种应用广泛的中药活性成分，临床用于治疗冠状动脉疾病、缺血性脑血管疾病以及肿瘤等[5]。有研究表明，川芎嗪具有多种生物活性，如抗氧化活性、对多种肿瘤细胞的细胞毒性、抑制血管平滑肌细胞增殖、预防内皮细胞损伤等[6]，川芎嗪还能抑制成纤维细胞合成胶原纤维[7]。还有研究显示，川芎嗪有影响哮喘病人气道重塑的能力[8]。然而其作用机制尚未阐明。本研究旨在观察川芎嗪对ORMDL3表达影响，为早期防治哮喘气道重塑提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

人支气管上皮(HBE)细胞(上海博古生物科技有限公司，CBNumber：CB35771380)；南美胎牛血清(FBS，维森特生物技术有限公司)；Trizol (上海普飞公司)；四甲基吡嗪(美国Sigma公司)；Primer、二甲基亚砜(DMSO)、MTT(上海吉凯基因医学科技股份有限公司)；RNase Inhibitor (Promega公司)；SYBR Master Mixture(TAKARA)；oligo dT (生工生物工程(上海)有限公司)。

1.2 研究方法

1.2.1细胞培养 HBE细胞加入RPMI-1640培养液(含体积分数0.10的FBS，10 000 kU/L青霉素、10 g/L链霉素)中，置于培养箱(37 ℃,含体积分数0.05 CO2)中培养，隔天换液，倒置显微镜下观察细胞生长情况，待细胞长至80%表面面积时传代。

1.2.2药物作用时间选择 取对数生长期HBE细胞接种于 96 孔板，每孔加入 1×104个细胞，应用含有体积分数0.10 FBS的RPMI-1640培养液，在37 ℃、含体积分数0.05 CO2、饱和湿度条件下培养24 h。另设空白组、对照组(加入相应体积的PBS)。每组设 6个平行复孔。分别培养24、48、72 h后，加入MTT溶液，培养箱孵育4 h。离心去上清后加入DMSO溶液，酶标仪检测570 nm 波长处吸光度(A)值。计算细胞存活率。细胞存活细胞率(%)=(实验组A值/对照组A值)×100%。

1.2.3川芎嗪浓度选择及实验分组 以100 μg/L的IL-4+IL-13培养的HBE细胞为模型组,分别加入不同浓度的川芎嗪(200、300、400、500、600、700、800 μg/L)作用72 h，观察川芎嗪对IL-4+IL-13诱导HBE细胞ORMDL3mRNA干预作用。以作用最明显的川芎嗪浓度作为实验浓度，将实验浓度的川芎嗪加入100 μg/L IL-4+IL-13培养HBE细胞作为治疗组，以100 μg/L IL-4+IL-13培养HBE细胞为模型组，以PBS培养HBE细胞作为空白组。3组培养时间均为72 h。

1.3 检测指标及方法

1.3.1RT-PCR方法检测ORMDL3mRNA表达取各组培养后的HBE细胞，采用Trizol法提取mRNA,按照RT-PCR试剂盒说明书将mRNA反转录成cDNA,使用RT-PCR方法检测ORMDL3mRNA表达。所用引物及其序列见表1。反应体系20 μL，内含：反转录产物5 μL，上下游引物共5 μL，SYBR Green 10 μL。以GAPDH为内参照。反应条件为：95 ℃，预变性30 s，1个循环；95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，40个循环；95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，95 ℃、5～10 min，1个循环。

表1 PCR引物及其序列

1.3.2Western blot方法检测ORMDL3蛋白表达取培养后的各组细胞，加入200 μg/L的RIPA裂解液，在冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min离心30 min。取上清液，行SDS-PAGE凝胶电泳，然后电转移至PVDF膜上，加入50 g/L脱脂奶粉，室温封闭2 h。加入兔抗人ORMDL3抗体(1∶200稀释)，4 ℃冰箱过夜，室温下TBST洗膜3次，加入1∶5 000稀释的羊抗兔二抗，常温孵育2 h；TBST室温下洗膜3次，光化学法显影，用Image J软件扫描各条带灰度值，以β-action(1∶200稀释)为内参照，以各条带灰度值/内参照灰度值表示ORMDL3蛋白表达。

1.3.3免疫组化检测ORMDL3蛋白表达 取各组细胞，制作细胞爬片。血清封闭，PBS漂洗，向切片上分别滴加ORMDL3抗体(Abcam107639，1∶200稀释)孵育过夜，PBS漂洗，二抗孵育，DAB显色。光学显微镜下观察，细胞棕色着色为ORMDL3蛋白阳性表达。应用Image J软件计算ORMDL3蛋白相对表达量。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 不同培养时间细胞存活率及不同药物浓度组ORMDL3 mRNA表达比较

培养24、48、72 h细胞存活率分别为(90.13±1.96)%、(94.51±1.91)%、(97.22±1.91)%，各时间比较差异有显著性(n=6，F=20.60，P<0.05)，培养72 h细胞存活率最高。后续实验以72 h为药物培养时间。200、300、400、500、600、700、800 μg/L浓度的川芎嗪作用HBE细胞72 h，其ORMDL3mRNA表达分别为2.472±0.178、0.763±0.058、0.823±0.142、0.994±0.059、0.978±0.038、1.084±0.079、0.947±0.036，各组比较差异有显著性(n=6，F=5.34,P<0.05)。400 μg/L川芎嗪对IL-4+IL-13诱导HBE细胞血清ORMDL3mRNA表达的干预作用最明显。后续实验以400 μg/L为川芎嗪药物浓度。

2.2 各组ORMDL3 mRNA表达比较

空白组、模型组、治疗组ORMDL3mRNA表达分别为0.947±0.036、1.000±0.0371、0.763±0.058，各组ORMDL3mRNA比较差异有显著性(n=6，F=176.45，P<0.01)。

2.3 各组ORMDL3蛋白表达比较

Western blot及免疫组化检测结果均显示，模型组、治疗组ORMDL3蛋白表达较空白组升高，治疗组较模型组降低，差异有统计学意义(F=23.48、91.56，P<0.01)。见表2和图1、2。

表2 各组ORMDL3蛋白表达比较

A:空白组;B:模型组；C:治疗组。

A:空白组;B:模型组；C:治疗组。箭头所示为ORMDL3阳性染色。DAB显色，400倍。

3 讨 论

哮喘病因为痰、虚、瘀，痰瘀互结是哮喘发作期的主要病机，治疗应以治痰活血并重。《读医随笔》云：“痰为血类，停痰与瘀血同治。”唐容川《血证论》说：“须知痰水之壅，由瘀血使然，但去瘀血则痰水自消。”哮喘的病机是“内有壅塞之气，外有非时之感，膈有胶固之痰。”临床研究发现，对于哮喘发作期及缓解期的寒哮、热哮证，川芎都有显著的疗效[9]。哮喘病儿久病正气不足，伏痰内生，气虚血瘀，故痰瘀互结是哮喘的主要病因病机。血瘀证贯穿于哮喘的始终。《本草纲目》有云：“川芎者，血中之气药。”川芎辛温香燥，走而不守，既能行散，上达巅顶；又入血分，下行可达血海，为血中之气药，能通达气血，活血祛瘀之功效显著。

现代医学研究认为，哮喘属于多基因遗传病,由环境因素和遗传因素共同作用而形成。ORMDL3基因位于17号染色体上,包括3个外显子和2个内含子,编码1个位于内质网膜的跨膜蛋白,可以通过调节Ca2+浓度导致未折叠蛋白反应,为哮喘炎性反应发生的内源性诱因[10]。哮喘的一个重要的病理特点是气道重塑。气道重塑可发生于成人及儿童哮喘病人，而ORMDL3基因高表达的儿童哮喘可能会加速早期气道重塑的进程[11]。既往研究已显示，ORMDL3过表达的转基因小鼠模型可出现气道炎症、气道重塑、气道高反应性和IgE水平升高[12]。

川芎嗪是川芎生物碱的主要成分之一，在我国被用于改善血液循环及缓解疼痛至少有2 000年的历史。川芎嗪(化学名称四甲基吡嗪)是自中药川芎分离提纯出来的一种酰胺生物碱，是一种钙离子拮抗剂，可影响器官血液流变学参数，有扩张血管、减轻炎症、抗脂质过氧化、抑制钙超载、减轻纤维化、抑制血小板聚集等作用。另外，川芎嗪还有降低气道高反应、改善气道炎症、调节免疫等作用[13-14]。

研究发现，川芎嗪对过敏性炎症反应和气道重塑具有抑制作用[16-17]。哮喘发病的主要机制是慢性气道炎症，而持续的慢性气道炎症可以引起气道重塑。已有研究表明，HBE细胞在过敏原和细胞因子(IL-4和IL-13)刺激下可诱导ORMDL3表达[15]；ORMDL3可通过激活ERK1/2/MMP-9信号通路影响哮喘气道炎症和气道重塑进展[16-18]。本研究应用IL-4+IL-13诱导HBE细胞ORMDL3过表达作为哮喘细胞模型，探讨川芎嗪对气道重塑的影响。结果显示，IL-4、IL-13可诱导HBE细胞ORMDL3mRNA过表达，400 μg/L浓度川芎嗪作用72 h可显著降低IL-4+IL-13诱导的HBE细胞ORMDL3mRNA和蛋白表达，说明川芎嗪可以抑制哮喘气道炎症和气道重塑。其机制可能为：川芎嗪是一种钙离子拮抗剂，可通过调节细胞内Ca2+浓度导致未折叠蛋白反应，从而减轻气道炎症反应，影响气道重塑进程。其具体机制需要进一步的实验证实。

综上所述,川芎嗪可能通过阻断IL-4+IL-13诱导所致HBE细胞ORMDL3蛋白过表达，在一定程度上改善哮喘气道重塑。本文研究结果为川芎嗪治疗哮喘及其机制研究提供依据。