赵伟曼，孙 瑞，郑利洁，杨健辉，李 敏，吕小东，董 雨，王清清

(蚌埠医学院药学院药物分析教研室，安徽 蚌埠 233000)

微针作为一种新型的透皮给药剂型，能突破传统经皮给药最大的屏障 (角质层) ，并且可以通过调节尺寸，不触及或较少触及痛觉神经，可实现无痛给药[1]。可溶微针(dissolving microneedles，DMNs)由水溶性或生物可降解聚合物材料组成，他们设计用于释放封装的药物，同时可以在皮肤内彻底溶解或降解而不产生生物危险的废物[2-3]。目前可溶微针不光用于一些生物大分子药物如疫苗、多肽、激素和核酸等的经皮给药[4-6]，越来越多的研究者也关注它在一些小分子给药的应用[7-8]。可溶微针在经皮给药方面显示出了令人瞩目的优势和前景。

川芎嗪(Tetramethylpy razine，TMP)，又称2，3，5，6-四甲基吡嗪，是从中药川芎分离提取的生物碱类物质，具有扩张血管、抗炎等药理作用。近年来，越来越多的研究表明川芎嗪可以用于类风湿性关节炎的治疗[9-11]。本实验选择右旋糖酐(dextran，DEX) 作为针部辅料，聚乙烯吡咯烷酮( polyvinyl pyrrolidone，PVP K90) 为基层辅料，川芎嗪作为类风湿性关节炎模型药物，两步注模干燥法制备川芎嗪可溶微针贴片[12]。

川芎嗪的定量分析法包括电位滴定法、紫外分光光度法、和色谱法等[13-16]。含量测定方法的选择要与待测物质所处的环境相适宜，因可溶微针贴片中还存在其他制针材料成分，且药物本身含量较低，所以本研究建立一种反相高效液相色谱法用于准确测定可溶微针中的川芎嗪含量，并进行方法学考察，为川芎嗪可溶微针贴片的后期质量研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 仪器高效液相色谱仪(日本岛津，LC-16)；精密电子分析天平(梅特勒-托利多，XP 205)； 台式高速离心机(赛默飞，Muitifuge X1R)；紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司，TU-1901)。

1.2 试剂及药品川芎嗪可溶微针贴片(实验室自制)；磷酸川芎嗪对照品(武汉欣欣佳丽生物科技有限公司，批号：201714，纯度>98%)；聚乙烯基吡咯烷酮(PVP K90，德国BASF，批号：L96014768E0)；右旋糖酐(Dextran，MW ca 40000，美国Alfa Aesar，批号：R16D019)；甲醇(上海麦克林生化科技有限公司，色谱纯)；水为超纯水。

1.3 方法

1.3.1 溶液的制备 (1)川芎嗪储备液的制备 精密称取磷酸川芎嗪对照品10.39 mg，用超纯水定容于100 mL容量瓶，储备液浓度为1039 μg/mL。(2)制针材料储备液的制备 精密称取Dex 10 mg和PVP K90 10mg，用超纯水于10 mL容量瓶中定容配制成浓度为1 mg/mL可溶微针制针材料储备液。(3)供试品溶液的制备 参考本实验前期研究[17]，用刀片将微针针部全部取下来，溶于1 mL超纯水中，作为供试品溶液。

1.3.2 色谱条件 色谱柱：Inertsil C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：A相为超纯水，B相为甲醇，比例为60∶40；流速：1 mL/min；检测波长：280 nm；柱温：25 ℃；进样量：20 μL。

2 结果

2.1 专属性试验取1.3.1制备的四种溶液(Dex溶液，PVP K90溶液，TMP对照品溶液，可溶微针供试品溶液)，按照1.3.2项色谱条件进样分析。如图1所示，川芎嗪保留时间为7.7 min，制针材料溶液在此时间无色谱峰出现，表明在此色谱条件下，制针辅料对川芎嗪的含量测定无干扰。

2.2 线性试验精密吸取一定量川芎嗪储备液并用超纯水稀释，得到浓度分别为1.039 μg/mL、2.078 μg/mL、5.195 μg/mL、10.39 μg/mL、25.975 μg/mL、51.95 μg/mL、103.9 μg/mL、129.875 μg/mL的一系列川芎嗪标准工作液。进入高效液相色谱仪进行分析，以川芎嗪浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标曲，线性回归方程为Y=39177X-3118.1 (R2=0.9999)。结果表明，川芎嗪在1.039～129.875 μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系(见图2)。

图1 Dex、PVP K90、磷酸川芎嗪和川芎嗪可溶微针的专属性试验色谱图

图2 川芎嗪的标准曲线

2.3 精密度试验

2.3.1 日内精密度 取浓度为2.078 μg/mL、25.975 μg/mL、103.9 μg/mL的川芎嗪标准工作液，按照1.3.2项色谱条件连续进样三次。结果见表1，所选取的低、中、高三个浓度的日内精密度RSD值均小于2%，平均RSD为1.89%。表明本方法的日内精密度良好。

表1 川芎嗪的日内精密度

2.3.2 日间精密度 取浓度为2.078 μg/mL、25.975 μg/mL、103.9 μg/mL的川芎嗪标准工作液，按照川芎嗪色谱条件连续进样3 d，记录峰面积。结果见表2，所选取的低、中、高三个浓度的日间精密度RSD值均小于3%，平均RSD为1.63%。表明本方法的日间精密度良好。

表2 川芎嗪的日间精密度

2.4 加样回收率试验取川芎嗪、DEX和PVP K90储备液，按照下面配比配制药物辅料混合溶液。混合辅料与川芎嗪比分别为20∶1，10∶1和5∶1，川芎嗪的浓度分别为12.9875 μg/mL、25.975 μg/mL和51.95 μg/mL，其中混合辅料浓度不变，DEX和PVP K90浓度均为100 μg/mL。将各混合液按照川芎嗪色谱条件进样分析，记录峰面积，并带入线性方程计算浓度及回收率，结果见表3。结果表明，川芎嗪的平均回收率在97.21%～98.72%之间。RSD均小于2%，平均RSD为1.42%。

表3 川芎嗪的加样回收率

2.5 重复性试验取实验室本自制的同一批6片川芎嗪可溶微针贴片，分别用手术刀片取每片微针的针部，溶于1 mL超纯水中。注入高效液相色谱仪，按照1.3.2项色谱条件进样分析，计算针部中川芎嗪的载药量，平均每片可溶微针贴片针部的川芎嗪载药量为136.28 μg，RSD为2.23%，方法重复性良好。

2.6 稳定性试验取2.5项下某一可溶微针贴片溶液，分别于0 h、1 h、4 h、8 h、12 h、24 h进样，测定峰面积RSD值为0.93%(n=6)，结果表明可溶微针贴片供试品溶液24 h内稳定性良好。

3 讨论

在现行的2015版《中国药典》中，川芎嗪原料药采用电位滴定法测定含量，因其具有碱性，选择高氯酸进行非水滴定；而对于制剂如川芎嗪片和川芎嗪胶囊则采用高效液相色谱法测定含量。也有文献报道为了排除辅料及杂质的干扰可以采用紫外分光光度法测定注射液中川芎嗪的含量。采用紫外分光光度计对磷酸川芎嗪对照品溶液及制针材料溶液进行扫描，发现磷酸川芎嗪在280 nm有最大吸收，并且专属性较好，所以选择280 nm作为检测波长。与光谱法比较，高效液相色谱法灵敏度较高，可溶微针贴片中载药量较小，所以选择高效液相色谱法来测定含量。采用药典中色谱条件的流动相甲醇-水(45∶55)分析时发现，川芎嗪峰形较差，而将流动相比例调整为40∶60，色谱峰峰形较好，且辅料溶液不干扰测定。所以最终选择甲醇-水(40∶60)作为流动相。

本文采用RP- HPLC 法测定川芎嗪可溶微针贴片中川芎嗪的含量，专属性强，精密度和准确度良好，重复性较好，方法简便可行，结果可靠，可用于测定可溶微针贴片中川芎嗪的含量，并为治疗类风湿关节炎的可溶微针提供方法依据。