王怡天， 吴寅龙， 余钒源， 吴凡子， 汪成林， 叶玲

1. 口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心 四川大学华西口腔医院牙体牙髓科，四川 成都（610041）； 2. 口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心 四川大学华西口腔医院，四川 成都（610041）； 3. 山东大学齐鲁医学院口腔医学院·口腔医院牙体牙髓科 山东省口腔组织再生重点实验室 山东省口腔生物材料与组织再生工程实验室，山东 济南（250000）

美国牙髓病学协会（American Association of Endodontics，AAE）关于再生性牙髓治疗的临床建议（2018 版）中提出，在血凝块或其他血液制品上需要覆盖一层盖髓材料。该盖髓材料需具有良好的封闭性和生物相容性。目前常用的盖髓材料为三氧化矿物凝聚体（mineral trioxide aggregrate，MTA）和Biodentine。临床研究发现，MTA 可能具有导致牙体颈部变色的美学风险［1-2］。临床上为避免MTA 材料导致的牙变色，往往采用牙颈部涂布粘接剂来避免材料进入牙本质小管从而发生反应。然而牙髓血运重建术中盖髓材料会长时间、大面积地与血液接触，甚至会有部分材料会完全沉浸于血凝块中，此时材料的变色会直接透过牙体组织导致变色。该类变色临床上更难以预防，因此牙髓血运重建术过程中对材料在与血液接触环境中的颜色稳定性有较高的要求。盖髓材料中，基于牙本质替代物设计理念的Biodentine 在光氧［3］、冲洗液［4-5］等接触条件下均表现出了良好的颜色稳定性。本研究旨在比较Biodentine 和MTA 与血液直接接触后的颜色稳定性。由于体内环境相较于体外实验环境更为复杂，因此本实验首先探究单纯的体外血液环境对Biodentine 和MTA 颜色稳定性的影响。本研究回答了两种材料在体外血液环境下的变色情况，是进一步探讨牙体变色有关因素的基础，为临床盖髓材料的使用提供依据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器

MTA（Dentsply，美国）；Biodentine（Septodont，法国）（表1）；硅橡胶（DMG 塞拉格，德国）；48 孔板（Corning，美国）；脱纤维羊血（九龙生物，郑州）；去离子水（Millipore，美国）。Crystaleye 分光光度计电脑比色仪（CE100-DC/EU，Olympus，日本）；佳能数码照相机（PowerShot SX720 HS，佳能，日本）；In-spect F50 扫描电镜（FEI Inspect F50，FEI，美国）；X射线能谱仪（INCA350，Oxford，美国）。

表1 两种材料的基本颜色和组成Table 1 Basic color and composition of the two materials

1.2 圆盘制备和处理

制作直径5 mm、高3 mm 的铝制圆盘，以此为模型使用硅橡胶制作圆盘印模。按照材料说明书调制Biodentine 和MTA，放入硅橡胶印模中，置于37 ℃、100%湿度的恒温箱中4 h。待材料固化后脱模，得到直径5 mm、高3 mm 的Biodentine 和MTA圆盘。

分组：采用随机数表法将同一材料的24 个圆盘随机平均分配到去离子水1 d 组、去离子水7 d组、脱纤维羊血1 d 组、脱纤维羊血7 d 组，每组6 个圆盘。于48 孔板中进行浸泡处理，避光放置于37 ℃恒温箱中。浸泡7 d 组中的液体（去离子水或脱纤维羊血）每天更换。

1.3 Biodentine 和MTA 圆盘颜色比较

1.3.1 比色法 使用去离子水对固化脱模后即刻、浸泡1 d 和7 d 后的圆盘冲洗5 min，晾干2 h 后使用Crystaleye 分光光度计电脑比色仪进行比色。每个圆盘重复测量3 次。所有测量均在同样的室内光照条件下进行，样本均按操作说明一致摆放。采用国际照明委员会CIE L*a*b*色度系统，获取材料表面各部的明度值（L*）、红绿色度坐标轴的色度值（a*）、黄蓝色度坐标轴上的色度值（b*）；与其在固化脱模后即刻的值L0*、a0*、b0*对应求差，得到ΔL、Δa、Δb。计算各组处理前后的色差值ΔE，

ΔE ＝［（L*-L0*）2+（a*-a0*）2+（b*-b0*）2］1/2。1.3.2 目测法 使用去离子水对固化脱模后即刻、浸泡1 d 和7 d 后的圆盘冲洗5 min，晾干2 h 后使用佳能数码相机在同样光照条件下对固化脱模后即刻、浸泡1 d 和7 d 后的圆盘进行拍照，观察比较圆盘的颜色变化。

1.4 表面形态观察

取固化脱模后即刻、浸泡1 d 和7 d 后的圆盘，使用去离子水冲洗后晾干，固定于基座，表面喷镀金属，于Inspect F50 场发射电子显微镜下观察材料表面，电压20 kV。扫描电镜下放大2 000倍、10 000倍观察不同处理条件下两种材料的表面形态。

1.5 元素含量检测

测定区域同1.4。用X 射线能谱仪测量固化脱模后即刻、脱纤维羊血组浸泡7 d 后的Biodentine和MTA 材料中钙、硅、碳、氧、铋、锆元素含量。

1.6 统计学分析

采用Graphpad Prism 6.0 软件进行统计分析。对各组计量资料进行正态性检验，数据服从正态分布用均数± 标准差（±s）表示，方差齐采用t 检验，方差不齐则用t′检验。检验水准α ＝0.05。

2 结 果

2.1 Biodentine 与血液接触条件下的颜色稳定性优于MTA

2.1.1 目测照片结果 去离子水组浸泡1 d 后Bio-dentine 和MTA 圆盘均没有出现明显的明暗度和色彩度的改变（图1）。脱纤维羊血组浸泡1 d 后Bio-dentine 圆盘表面有较多血色物质吸附，色彩度上发生一定程度的改变，但明暗度上并没有明显变化；而MTA 圆盘表面只有一小部分血色物质吸附，在明暗度上发生目测可见的改变。去离子水组浸泡7 d 后Biodentine 圆盘在颜色上变化较小且表面有白色晶体析出；而MTA 圆盘颜色变化较大：暗度增加且颜色偏黄。脱纤维羊血组浸泡7 d 后两者均发生较大变化，其中Biodentine 圆盘颜色略有加深偏红而MTA 圆盘暗度明显增加且颜色加深变红。

2.1.2 比色仪结果 Biodentine 和MTA 圆盘在去离子水和脱纤维羊血组浸泡1、7 d 后，处理前后色差值变化ΔE 见表2。去离子水组浸泡1 d 后Bioden-tine 的色差值ΔE（2.937 ± 0.099）低于MTA 的ΔE（6.163 ± 0.241），差异有统计学意义（t＝21.437，P ＜0.001）。脱纤维羊血组浸泡1 d 后Biodentine 的ΔE（6.790 ± 0.831）与MTA 的ΔE（6.233 ± 0.888）之间差异没有统计学意义（t＝0.793，P＝0.472）。去离子水组浸泡7 d 后Biodentine 的色差值ΔE（4.063± 0.450）低 于MTA 的ΔE（13.427 ± 0.926）（t＝15.752，P ＜0.001）。脱纤维羊血组浸泡7 d 后Bio-dentine 的ΔE（5.833 ± 0.501）也 低 于MTA 的ΔE（21.257 ± 0.955），差 异 具 有 统 计 学 意 义（t＝24.781，P ＜0.001）。在去离子水组浸泡1、7 d 和在脱纤维羊血组浸泡7 d 后Biodentine 的色差值均低于MTA 的色差值，而在脱纤维羊血组浸泡1 d 的两种材料圆盘色差值之间差异无统计学意义。以上结果表明：与血液长时间接触后Biodentine 的颜色稳定性优于MTA。

Figure 1 Photographs of Biodentine and MTA discs immersed in deionized water or defibrinated sheep blood at different time points图1 Biodentine 和MTA 圆盘浸于去离子水或脱纤维羊血中不同时间的照片

就材料自身与液体接触前后的色度变化而言，Biodentine 在去离子水组浸泡7 d 的ΔE 比1 d的ΔE 略高（t＝4.239，P＝0.013）；而在脱纤维羊血组浸泡7 d 的ΔE 与1 d 的ΔE 差异无统计学意义（t＝1.707，P＝0.163）。MTA 在去离子水组和脱纤维羊血组浸泡7 d 后的ΔE 均高于相应1 d ΔE，差异具有统计学意义。见表2。上述结果表明：在与血液接触的环境中，Biodentine 具有较好的颜色稳定性且优于MTA。

表2 Biodentine 和MTA 圆盘浸于去离子水或脱纤维羊血中不同时间的色差值ΔETable 2 ΔE of Biodentine and MTA discs immersed in deionized water or defibrinated sheep blood for 1 day or 7 days ±s

表2 Biodentine 和MTA 圆盘浸于去离子水或脱纤维羊血中不同时间的色差值ΔETable 2 ΔE of Biodentine and MTA discs immersed in deionized water or defibrinated sheep blood for 1 day or 7 days ±s

The horizontal direction shows the statistical results of the 7th day ΔE and the 1st day ΔE of the material itself in the same immersion liquid. The verti-cal direction shows the statistical results of the two materials ΔE under the same conditions. There was no statistically significant difference between the 7th day ΔE and the 1st day ΔE of Biodentine immersed in defibrinated sheep blood. There was a statistically significant difference between the 7th day ΔE and the 1st day ΔE MTA immersed in defibrinated sheep blood.MTA:mineral trioxide aggregate

t P t P Biodentine MTA 4.239 13.145 0.013＜0.001 1.707 19.956 0.163＜0.001 tP Deionized water 1 d 2.937±0.099 6.163±0.241 21.437＜0.001 Deionized water 7 d 4.063±0.450 13.427±0.926 15.752＜0.001 Defibrinated sheep blood 1 d 6.790±0.831 6.233±0.888 0.793 0.472 Defibrinated sheep blood 7 d 5.833±0.501 21.257±0.955 24.781＜0.001

ΔE 的构成包括明度、红绿色度、黄蓝色度差值（ΔL、Δa、Δb），分析上述三个细化指标后发现：MTA 色度变化的主要来源是明度差值ΔL，且无论在去离子水或者血液浸泡的条件下7 d 后的明度差值ΔL 都远大于Biodentine（图2）。在红绿色度差值（Δa）方面差异具有统计学意义；黄蓝色度差值（Δb）方面，MTA 与Biodentine 在血液浸泡后的变化差异无统计学意义。上述结果表明，Biodentine在血液环境中颜色稳定性高于MTA 的主要原因就是其明度稳定性更高。

Figure 2 Comparison of ΔL，Δa and Δb of Biodentine and MTA immersed in deionized water or defibrinated sheep blood for 7 days图2 Biodentine 和MTA 浸于去离子水或脱纤维羊血中7 d 的ΔL、Δa、Δb 比较

2.2 Biodentine 和MTA 表面形态变化趋势不同

使用扫描电镜观察到Biodentine 圆盘未处理时表面孔隙率小（图3）。去离子水组浸泡后Bioden-tine 圆盘表面可见片状结晶，而在脱纤维羊血组浸泡后表面亦有结晶但数量少于去离子水组。MTA圆盘未处理时表面可见片状晶体，在去离子水浸泡后表面有边缘较锐的结晶，但在脱纤维羊血组浸泡后表面结晶边缘变圆钝。值得注意的是两种液体环境下各时间点时MTA 的孔隙率都明显大于Biodentine。

2.3 Biodentine 和MTA 材料中元素含量变化不同

X 射线能谱仪测量结果显示（图4）：脱纤维羊血组浸泡7 d 后，MTA 中氧元素含量下降、铋元素含量上升，提示其阻射剂成分氧化铋可能分解成金属铋。Biodentine 因阻射能力低未被检测出锆元素（X 射线检测发现Biodentine 的阻射能力低于MTA），但其他元素氧、钙、硅含量稳定，提示其阻射剂成分氧化锆可能较为稳定，不易分解。

3 讨 论

作为一种骨水泥封闭剂，MTA 因其良好的生物相容性、强密合性、抑菌性等优点在临床应用广泛，但其潜在的变色风险仍是美学修复中不可忽视的问题［1-2］。关于其变色原因多数研究认为：MTA 中阻射剂成分氧化铋会受光氧、冲洗液环境影响分解生成黑色金属、或反应生成有色的碳酸铋从而变黑；以及其他金属氧化物造成的变色［6-7］。此外材料组分氧化铋可与牙本质内胶原成分反应发黑［8］，血液接触也可能与变色有关［9］。许多离体牙实验设计未能清楚划分造成变色的几种因素，得到材料本身及生物成分原因混合影响的结果［8-11］。综上，造成牙体颜色变化的可能原因包括：与血液接触后材料本身颜色不稳定；材料、血液渗入牙本质小管与管内胶原成分发生反应；血液本身影响牙齿颜色。本实验首先研究体外血液环境下材料的颜色稳定性，推测牙体变色是否与上述第一个可能因素即材料在血液接触条件下的颜色稳定性有关。本研究设计体外实验排除了生理条件中各种复杂因素的干扰，能够单纯并直接地观察材料本身受血液影响的情况。

Figure 3 Morphological characteristics of Biodentine and MTA discs immersed in deionized water or defibrinated sheep blood at different time points detected by scanning electron microscopy图3 扫描电镜检测浸于去离子水或脱纤维羊血中不同时间的Biodentine 和MTA 的形态学特征

Figure 4 Results of elemental content determination of Biodentine and MTA discs immersed in defibrinated sheep blood for 7 days compared with untreated discs图4 脱纤维羊血组浸泡7 d 的Biodentine、MTA 与未处理组元素含量测定结果

关于Biodentine 和MTA 在血液环境中的颜色稳定性研究，有报道曾在离体牙根管内放置泡沫塑料后注入人血，釉牙骨质界处放置MTA 及Bio-dentine 等硅酸钙类骨水泥材料后封闭根管两端［12］。该研究的结果发现：随着时间延长各组间的牙体变色均加重，但各材料间的变化没有统计学意义［12］。但上述研究存在以下局限：①人体血液在体外会迅速凝固，因此在注入血液的过程中可能出现局部的凝集；②泡沫导致血液与材料接触面积受限。因此该实验的方法设计尚不能准确评估各材料与血液接触后的颜色稳定性。而截止目前其余关于血液影响材料颜色的研究也仅是模拟血液污染如放置血液饱和的棉球［13-14］，这也不能反映治疗中材料与血液长期接触的真实情况。为了避免上述实验的问题，本实验采用浸泡方式使材料圆盘与血液接触完全并选择羊血脱纤维处理确保血液不会发生凝固。在本实验的条件下，笔者得出结论：在体外与血液接触的环境中，Bioden-tine 的颜色稳定性优于MTA。

骨水泥材料引起牙体变色的多项独立研究显示，MTA 在处理7 d 后已明显致色［10，15］。本实验依此选择7 d 为检测时间点，灵敏且经济地完成检测。本实验是针对体外血液环境进行的研究，故设置成分单一的液体环境即去离子水作为对照，排除一切可能存在的盐离子影响。实验采用脱纤维羊血避免血液凝固，关于脱去的纤维蛋白原是否会对材料致色产生影响目前尚无报道，还需进一步实验来回答。

本研究目测照片中去离子水组MTA 材料圆盘发生颜色变化，其ΔE 均高于Biodentine 相应组别，主要与MTA 材料组分、性质有关。MTA 中存在多种金属元素，其分解释放会降低材料明度；去离子水的浸泡会一定程度上改变材料表面孔隙率。就MTA 圆盘而言，脱纤维羊血浸泡7 d 相比于去离子水浸泡7 d 颜色发生较大改变。已知血液红细胞会引起牙体变色［16］，由早期偏红色逐渐转为暗棕色。研究认为红细胞溶血是明暗度变化的原因。有研究提示，硅酸钙类材料与血液接触时变色加快［9］，但具体原因尚不明确。有学者认为，MTA 中少量三价铁会导致变色，且血红蛋白中二价铁因发生氧化还原反应转化为三价铁而变色［17］。血液还会吸附在材料表面，导致变色并抑制水化过程［18-19］，降低材料表面孔隙率，这与本研究的扫描电镜结果一致，浸泡在血液组的材料表面孔隙率均有降低，提示材料表面存在血液的吸附。

在比较几类骨水泥材料对牙体颜色影响的相关研究中，Biodentine 会造成牙体变色但致色情况低于MTA［20］。学者的分析结论与本实验研究结果一致，Biodentine 金属元素含量少、阻射剂由氧化铋更换成了稳定性更高的氧化锆（不易分解），这有助于颜色稳定性。这些离体牙实验设计中都存在材料和牙本质的接触。而已有研究表明防止牙本质小管内胶原成分的降解可大大改善牙体变色［21］说明牙本质成分对牙体颜色有较大影响。此外，血液污染也是引起牙体变色的重要因素。有研究显示血液污染材料后处理好的牙体避光保存于37 ℃180 d 进行检测，MTA、Biodentine 均造成牙体变色［22］。但从其结果可见，检测时长达180 d 时Biodentine 组的变色情况较轻，MTA 组变色较重。综上可知，现有研究条件下Biodentine 的颜色稳定性总是优于MTA。尽管实际使用中Biodentine 也存在造成牙体变色的情况，但美学修复效果与MTA 相比已获得较大改善。

关于本实验发现Biodentine 具有更高的颜色稳定性的机制之一，即阻射剂的更换，以下问题在临床实践中需要纳入考虑。X 射线能谱（energy dis-persive spectroscopy，EDS）分析结果表明：在血液环境中浸泡后Biodentine 的氧元素含量都没有变化，提示其阻射剂氧化锆成分稳定未分解；而MTA的阻射剂氧化铋稳定性低于氧化锆。虽然Bioden-tine 更换阻射剂成分减轻了其变色的风险，但Bio-dentine 的阻射能力低［23］有可能会给牙体牙髓治疗带来不便，因此在实际应用时需综合考虑需求进行选择。

临床治疗中材料与血液接触时处于未完全凝固的状态。在牙髓血运重建术过程中该部分未完全凝固即接触血液的材料往往位于牙釉本质界以下3 mm，其变色与临床口内可见的牙体部分关系不大。而与临床口内可见的牙体变色密切相关的通常是靠近牙釉质牙本质界的材料部分，因此本实验选择材料凝固后浸泡处理来模拟临床。尽管本实验不能完全模拟实际临床操作状态，但本实验为比较两种材料在血液接触条件下的颜色稳定性提供了最基础和有力的体外证据。后续本课题组将设计体内试验模拟临床操作状态，探讨实际治疗中材料盖髓对牙体颜色的影响；同时会考虑使用粘接剂封闭牙本质小管，探究临床操作中若减少材料与牙本质小管的接触能否改善牙体变色。该设计或许可以分析回答临床使用Biodentine也会出现牙体变色的原因，并有助于探寻美学修复方面更优秀的治疗方案。

综上，本研究发现在体外与血液接触的条件下Biodentine 的颜色稳定性优于MTA。原因包括：Biodentine 的表面形态和晶体结构在血液接触环境中较MTA 更稳定，且Biodentine 的阻射剂及氧化物组分与血液接触后也表现出更好的稳定性。但由于Biodentine 更换阻射剂后带来的阻射能力降低，在临床应用时需综合考虑。

【Author contributions】 Wang YT，Wu YL wrote the article. Yu FY，Wu FZ，Wang CL performed the experiments，and analyzed the data. Ye L designed the study，and revised the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.