罗晓娜， 刘向晖， 王博， 刘昕， 谢晓华

1.哈尔滨医科大学附属第二医院口腔科，黑龙江 哈尔滨（150086）； 2.黑龙江省第二医院口腔科，黑龙江 哈尔滨（150086）

牙釉质作为覆盖在牙冠表面的高度矿化组织［1］，由成釉细胞分泌形成［2］。成釉细胞的分化受到上皮-间充质作用的调节［3］，这一过程由多种信号分子调控，其中转化生长因子-β（transforming growth factor β，TGF-β）和骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）被认为是调节釉质发育最重要的信号分子［4-6］。作为TGF-β 和BMPs 的非经典信号通路，p38 丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen activated protein kinase，p38 MAPK）通路可通过级联反应传递信号；上游激酶MAPK 激酶激酶（MAP3K）和MAPK 激酶（MAP2K）可通过活化环中苏氨酸和酪氨酸的双磷酸化激活p38 MAPK；活化后的p38 可磷酸化细胞质和细胞核中的多种底物，引起蛋白质功能和基因表达的变化，从而执行炎症、凋亡、细胞分化和细胞周期调节等生物反应［7］。

既往研究发现，p38 MAPK 非经典通路参与BMPs 和TGF-β1 协同诱导的人牙龈上皮细胞向成釉细胞分化的过程［1］。Greenblatt 等［8］发现小鼠中p38α 的上皮特异性缺失可导致牙尖形态和釉质分泌的缺陷。目前，p38 MAPK 信号通路与釉质发育分子机制的研究尚不完全清楚。本研究通过将SB203580加入体外培养小鼠牙胚的培养基中，观察抑制小鼠牙胚中p38 MAPK 信号通路对成釉上皮中釉质发育相关基因表达的影响，为p38 MAPK 非经典信号通路与釉质发育分子机制的研究提供基础。

1 材料和方法

1.1 主要材料与仪器

本研究所用动物为出生2 d（Postnatal 2，PN2）的ICR 小鼠，购自哈尔滨医科大学附属第二医院实验动物中心，本实验通过哈尔滨医科大学附属第二医院伦理委员会审批。

DMEM 培养基（Hyclone，美国）；青霉素（Sig-ma，美国）；链霉素（Sigma，美国）；SB203580（Sig-ma，美国）；PBS 缓冲液（索莱宝，中国）；Trizol 试剂（Invitrogen，美国）；逆转录试剂盒（Takara，日本）；SYBR Premix Ex Taq 试剂盒（Takara，日本）；BCA 蛋白定量试剂盒（碧云天，中国）；SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒（碧云天，中国）；兔抗小鼠抗体：Pan-p38（CST，美国）；p-p38（CST，美国）；GAPDH（CST，美国）；HRP 标记的山羊抗兔二抗（索莱宝，中国）。

体视显微镜（SMZ445，谱锐西玛，中国）；超净工作台（1300 SERIES A2，Thermo，美国）；细胞恒温孵育箱（371，Thermo，美国）；超高速低温离心机（Heraeus Multifuge X1R，Thermo，美国）；电泳仪（164-5050，BIO-RAD，美国）；电转仪（164-5050，BIO-RAD，美国）；恒温电子摇床（MAXQ 4450，Thermo，美国）；Western Blot 显色仪（5200，天能，中国）；实时定量PCR 仪（QuantStudio 3，Thermo，美国）。

1.2 方法

1.2.1 牙胚器官培养 体视显微镜下解剖出生2 d的ICR 小鼠下颌第一磨牙牙胚（图1），将牙胚置于含有100 μg/mL 链霉素、100 U/mL 青霉素和10%胎牛血清的DMEM 培养基中，于细胞恒温孵育箱中培养24 h。

1.2.2 实验分组 根据处理条件不同，将培养基中加入20 μmol/L DMSO 溶解的SB203580 处理后的

Figure 1 The appearance of the tooth germ of the mouse mandibular first molar 2 days after birth observed under a stereomicroscope图1 体视显微镜下观察到出生2 d 的小鼠下颌第一磨牙牙胚外观

牙胚作为实验组（SB203580 组）；培养基中加入等量DMSO 处理的牙胚作为对照组（Control 组），每组培养基内放置6～8 个牙胚。培养完成后，在体视显微镜下于碳酸盐缓冲液中分别分离两组下颌第一磨牙牙胚的上皮和间充质，收集下颌第一磨牙牙胚的上皮组织并对其进行研究分析。

1.2.3 Western blot 使用RIPA 裂解液分别提取匀浆处理后的SB203580 组和对照组的总蛋白，采用BCA 法测定蛋白浓度，制备蛋白样品。取30 μg 蛋白样品加入制备完成的10%SDS-PAGE 凝胶孔内，经电泳分离蛋白并转移至PVDF 膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h，加入p38（1∶1 000）、p-p38（1∶1 000）的一抗稀释液以及内参GAPDH（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，复温1 h 后TBST 洗涤，加入相应的二抗稀释液（1∶5 000），室温孵育2 h，TBST 洗膜后于化学发光显色仪上曝光、显影，采用Image J 软件分析蛋白条带的灰度值。

1.2.4 实时定量PCR 采用Trizal 法提取培养完成的下颌第一磨牙上皮组织中的RNA，紫外分光光度计测定RNA 浓度。使用逆转录试剂盒将RNA 逆转录为cDNA。根据SYBR®Premix Ex TaqTM 试剂盒说明书进行荧光定量PCR检测。Runt相关转录因子2（runt-related transcription factor 2，Runx2）、成骨细胞特异性转录因子（osterix，Osx）、牙成釉细胞相关蛋 白（odontogenic ameloblast associated protein，ODAM）、釉成熟蛋白（amelotin，AMTN）、基质金属蛋白酶20（matrix metalloproteinase 20，MMP20）和激肽释放酶4（kallikrein 4，KLK4）引物由通用生物系统（安徽）有限公司合成，引物序列见表1。反应体系均为20 μL，具体组成如下：1 μL cDNA、上游引物和下游引物各1 μL、10 μL SYBR Green、7 μL DEPC水。反应条件为：94 ℃1 min，95 ℃15 s，60 ℃30 s，40 次循环。每个样品进行三次重复，结果采用2-ΔΔCt法进行计算。

表1 实时定量PCR 引物Table 1 Primers for real-time PCR

1.3 统计学分析

采用GraphPad Prism 8.0 软件进行数据分析，所有数据符合正态分布，数据以均数± 标准差表示，组间比较采用独立样本t 检验，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 p38 MAPK 磷酸化水平的变化

Western blot 结果显示，与未加入p38 MAPK 抑制剂SB203580 的对照组相比，实验组的成釉上皮中p38 MAPK 的磷酸化水平下降，差异有统计学意义（P＝0.002）（图2）；表明SB203580 可抑制小鼠牙胚成釉上皮中p38 MAPK 的磷酸化。

2.2 转录因子Runx2 和OSX 的变化

实时定量PCR 结果显示，与对照组相比，抑制剂SB203580 处理后的成釉上皮中Runx2 和Osx 的mRNA 表达水平下降，差异有统计学意义（P ＜0.01，表2）；说明抑制p38 磷酸化可以抑制牙胚发育过程中成釉上皮中转录因子Runx2 和Osx 的表达。

表2 实时定量PCR 检测SB203580 对成釉上皮中Runx2 和Osx 表达的影响Table 2 Real-time PCR to detect the expression levels of Runx2 and Osx in the enamel epithelium treated with SB203580 ±s，n=3

表2 实时定量PCR 检测SB203580 对成釉上皮中Runx2 和Osx 表达的影响Table 2 Real-time PCR to detect the expression levels of Runx2 and Osx in the enamel epithelium treated with SB203580 ±s，n=3

Runx2:runt-related transcription factor 2;Osx:Osterix

Group Control SB203580 tP Runx2 1.00±0.04 0.74±0.07 5.89 0.004 Osx 1.00±0.10 0.60±0.07 5.64 0.005

2.3 成釉细胞标志物的变化

实时定量PCR 结果显示，与对照组相比，SB203580 作用24 h 后，成釉上皮中的ODAM、AMTN、MMP20 和KLK4 的mRNA 表达水平明显下降，差异有统计学意义（P ＜0.05，表3）；表明在牙胚发育过程中，抑制剂SB203580 可以负向调控成釉细胞标志物的表达。

3 讨 论

釉质发育主要分为分泌和成熟两个功能阶段。分泌阶段，成釉细胞分泌釉原蛋白、成釉蛋白和釉蛋白等釉质基质蛋白进入釉质空间，同时分泌MMP20 以降解加工釉质蛋白，使釉质晶体轴向生长。而成熟阶段的成釉细胞减少了釉质蛋白的表达，并分泌KLK4 以清除釉质层中的釉质基质蛋白［9］，此时钙和磷酸盐在釉质空间内快速沉积于釉质晶体的侧面增加其宽度和厚度［10］，使釉质达到最终的矿化形式。研究发现，小鼠下颌第一磨牙的釉质形成开始于出生后1～2 d，此时处于钟状晚期的下颌第一磨牙牙胚被认为是研究釉质发育的最佳时机［11］。而从实验的可操作性上，出生2 d小鼠的下颌第一磨牙牙胚更易于制取，因此本研究选择出生2 d 的ICR 小鼠用于实验观察。

表3 实时定量PCR 检测SB203580 对成釉上皮中ODAM、AMTN、MMP20 和KLK4 表达的影响Table 3 Real-time PCR to detect the expression levels of ODAM,AMTN,MMP20 and KLK4 in the enamel epithelium treated with SB203580 ±s，n=3

表3 实时定量PCR 检测SB203580 对成釉上皮中ODAM、AMTN、MMP20 和KLK4 表达的影响Table 3 Real-time PCR to detect the expression levels of ODAM,AMTN,MMP20 and KLK4 in the enamel epithelium treated with SB203580 ±s，n=3

ODAM: odontogenic ameloblast associated protein; AMTN：amelotin;MMP20:matrix metalloproteinase 20;KLK4:kallikrein 4

Group Control SB203580 tP ODAM 1.00±0.10 0.39±0.05 7.445 0.018 AMTN 1.00±0.01 0.13±0.01 69.87＜0.001 MMP20 1.00±0.04 0.52±0.09 8.629 0.001 KLK4 1.00±0.11 0.44±0.01 8.847 0.001

有研究表明，抑制剂SB203580 已广泛应用于各种实验研究，其可通过与p38 上的ATP 位点竞争性结合，进而抑制p38 MAPK 的催化活性［12］。本实验采用p38 MAPK 抑制剂SB203580 对体外培养的小鼠下颌第一磨牙牙胚进行处理：Western blot 结果显示，在抑制剂SB203580 的作用下，成釉上皮中p38 磷酸化蛋白表达下降，这说明SB203580 阻断了小鼠牙胚成釉上皮中p38 MAPK 信号通路；同时，实时定量PCR 结果表明，SB203580 可抑制成釉上皮转录因子Runx2 和Osx 的表达。已有研究表明，小鼠中Runx2 的靶向破坏可导致骨骼和牙齿发育停止［13-14］。人体中Runx2 遗传障碍会导致颅骨发育不良和牙齿异常［15］。此外，Runx2 可通过促进KLK4 的合成抑制釉原蛋白、成釉蛋白和釉蛋白的合成［16］，进而调控釉质的成熟。同时，研究指出Runx2 可通过直接与Amtn 启动子内的Runx2 位点结合而上调成釉细胞中Amtn 基因表达，以调节釉质矿化［17］。作为Runx2 的下游靶点，Osx 缺乏可导致牙齿发育过程中成釉细胞分化中断，这表明Osx是釉质发育所必需的［18］。有研究发现p38 MAPK可通过调控Runx2 和Osx 的表达介导成骨细胞分化［19-20］。因此，在牙胚发育过程中，p38 MAPK 信号通路可能通过Runx2 和Osx 调节釉质的形成。

釉质蛋白ODAM 可通过调节MMP20 参与釉质的矿化［21］。AMTN 可通过促进羟基磷灰石沉积影响釉质表层的矿化［22］。此外Amtn 基因缺失小鼠的下颌切牙呈白垩色外观，且釉质表面粗糙不规则［23］。过表达Amtn 的转基因小鼠的釉质薄且结构紊乱［24］。这表明釉质蛋白ODAM 和AMTN 在釉质形成中的具有重要作用。蛋白酶MMP20 和KLK4 可通过促进釉质蛋白去除，以释放釉质基质内的空间，这对正常牙釉质的形成至关重要［25-26］。本研究结果显示，p38 MAPK 抑制剂SB203580 可下调成釉细胞标志物ODAM、AMTN、MMP20 和KLK4的表达水平，这提示成釉上皮中p38 MAPK 信号通路可能通过调控ODAM、AMTN、MMP20 和KLK4 的表达参与釉质发育。同时，本课题组前期研究发现，Bmp2 和Bmp4 上皮条件性缺失的小鼠表现为釉质生成不良且成釉细胞中MMP20 和KLK4 的表达下降［27］，但是否通过p38 MAPK 非经典信号通路调控MMP20 和KLK4 的表达进而导致釉质生成不良，仍需进一步研究。此外，有研究称p38 MAPK途径可影响BMP 的表达［28-29］。本研究抑制牙胚成釉上皮中p38 MAPK 信号通路对釉质发育相关基因表达的影响，但尚未探究p38 MAPK 途径对牙胚成釉上皮中BMP 表达的影响，因此本课题组后续将对此进行研究分析，以更深入探索p38 MAPK 信号通路对釉质发育影响的机制。

本研究通过体外培养小鼠牙胚，发现p38 MAPK 信号通路可通过调控成釉上皮中转录因子Runx2、Osx 及 成 釉 细 胞 标 志 物ODAM、AMTN、MMP20 和KLK4 的表达介导釉质发育，这为非经典信号通路调控釉质发育的机制研究提供思路，也为预防和治疗发育缺陷或受损的釉质相关疾病提供依据。

【Author contributions】 Luo XN wrote the article. Liu XH，Wang B，Liu X revised the article. Xie XH designed the study. All authors read and approved the final manuscript as submitted.