王奕丹张 磊王建楠伍慧茹张 玲杨 洋隋汝波*

(1.锦州医科大学附属第一医院神经内科,辽宁 锦州 121000； 2.锦州医科大学护理学院,辽宁 锦州 121000)

PSD 是脑卒中后出现的一类情感障碍性疾病,增加了患者的致残率及死亡率[1-2]。 然而,其发病机制尚不明,有多种学说并存[3],其中单胺类神经递质学说最具代表性。 然而,目前单纯补充单胺类神经递质的药物(如选择性5-HT 再摄取抑制剂,SSRIs)对PSD 患者疗效欠佳,且存在起效慢、毒副作用大、复发率高等问题[4],因此为PSD 寻找新的治疗药物势在必行。

经临床观察发现,患有风湿类疾病的PSD 患者在应用免疫抑制剂后可改善PSD 样表现。 并且有研究显示,卒中后激活的免疫炎症反应使吲哚胺2,3-双加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO)和下丘脑-垂体-肾上腺轴(hypothalamo-pituitaryadrenal axis, HPA)过度表达[5],最终导致单胺类神经递质的耗竭[6]。 因此可以猜测,抗炎可能会提高单胺类神经递质的水平,进而改善PSD 样表现。 为此本实验选用免疫抑制剂FTY720 进行干预,采用行为学、分子学及基因学等实验方法证实FTY720可改善PSD 大鼠的抑郁行为,提高单胺类神经递质的水平。 本研究将为PSD 的治疗提供新思路。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF 级SD 大鼠60 只,雄性,6 ～7 周龄,体重(200 ± 20)g,购自锦州医科大学动物实验中心[SCXK(辽)2017-0006]。 饲养于锦州医科大学SPF 动物实验中心[SYXK(辽)2019-0007]。 动物实验研究由锦州医科大学审批(IACUC 2019007),按照实验动物使用的3R 原则予以人道关怀。

1.2 主要试剂与仪器

FTY720 源自美国Sigma 公司,CAS:162359-56-0；盐酸氟西汀胶囊,礼来(苏州)制药有限公司,国药准字J20170022；ELISA 检测试剂盒(美国R&D 公司,5-HT 批号:L190408615,NE 批号:L190501419,DA 批号:L190402208)；酶标仪(批号:ELX-800,美国BIOTEK 公 司)； 荧 光 定 量 PCR 仪(批 号:Exicycler 96,韩国BIONEER 公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组及模型建立

大鼠适应性饲养1 周后行旷野实验,选取评分相近的60 只大鼠随机分为假手术组(n=10)和模型组(n=50)。 假手术组除颈总动脉不插入栓线外,余操作相同。 模型组大鼠参照Zealonga 线栓法[7]制备大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型。 术后24 h 行Zealonga 神经行为学评分,选取评分1 ～3 分的大鼠入组[7-8]。 将MCAO 模型制备成功的大鼠再随机分为卒中组(n=10)、PSD 组(n=10)、FLU 组(n=10)及联合治疗组(n=10)。 其中PSD 组、FLU 组及联合治疗组大鼠在MCAO 术后第3 天单笼饲养并加以Willner 等[9]和Katz 等[10]方法改良的慢性不可预知的温和性刺激(CUMS),包括:①禁食禁水20 h；②禁水17 h；③潮湿垫料21 h；④45°倾斜鼠笼17 h；⑤行为限制2h；⑥持续照明17 h；⑦4℃冰浴游泳5 min；⑧水平震荡鼠笼5 min；⑨夹尾1 min,每日随机采取一种刺激方式,持续28 d。

1.3.2 给药剂量及方法

治疗组于慢性应激刺激第1 天时腹腔注射给药。 FLU 组:盐酸氟西汀溶液(5 mg/kg),联合治疗组:盐酸氟西汀溶液(5 mg/kg)+FTY720(1 mg/kg)。假手术组、卒中组、PSD 组予等体积去离子水。

1.3.3 行为学指标测定

(1)旷野实验:参照Papp 等方法[11]制黑壁白底80 cm×80 cm×50 cm 无盖纸箱,底部分为25 个等格,将大鼠置于中央格内,待大鼠从中央格启动后记录,以穿越底面格数为水平运动得分,1 格计1分,以直立次数为垂直运动得分,动物双足离开底面,无论站立多长时间直至双足放下计1 分,每次记录5 min。

(2)蔗糖水消耗实验:参照Willner 等方法[9],实验前训练大鼠饮用1%蔗糖水。 大鼠禁食水20 h后,给予1 瓶1%蔗糖水和1 瓶蒸馏水,1 h 后取出,测定大鼠蔗糖水消耗量与总液体消耗量比值。

1.3.4 ELISA 法检测大鼠海马中5-HT、NE、DA含量

大鼠于末次行为学指标测定后断头取脑,冰上分离海马组织,放入匀浆器中,加入生理盐水在冰浴中磨成匀浆液,离心20 min 后取上清。 按ELISA试剂盒说明书操作,测定5-HT、NE、DA 含量。

1.3.5 Real-time PCR 法检测大鼠海马中TPH2mRNA、TH mRNA 的表达

取适量海马组织根据试剂盒说明书提取样本RNA,进行逆转录得到cDNA 样本后用TPH、TH 的特异性引物进行荧光定量PCR 扩增,采用2-△△CT方法进行荧光定量分析。 引物序列见表1。

1.4 统计学方法

所有数据采用SPSS 20.0 进行分析。 计量资料符合正态性分布和方差齐性,不同组别间对比采用方差分析,同时分析时间和组别关系时采用重复测量方差分析,两两对比采用LSD-t检验,结果以平均数±标准差(±s)表示,以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 旷野实验

(1)水平运动得分

第1 天时,造模的四组大鼠与假手术组大鼠相比水平运动次数减少(P＜0.05)。 第15、22、29 天时,与假手术组、卒中组比,PSD 组大鼠水平运动次数逐渐减少(P＜0.05)；与PSD 组比,FLU 组与联合治疗组大鼠水平运动次数显著增加(P＜0.05)；二者组间比较差异具有统计学意义(P＜0.05)(见表2)。

(2)垂直运动得分

第1 天时,造模的四组大鼠与假手术组大鼠相比垂直运动次数减少(P＜0.05)。 第15、22、29 天时,与假手术组、卒中组比较,PSD 组大鼠垂直运动次数明显减少(P＜0.05)；与PSD 组比较,FLU 组与联合治疗组大鼠垂直运动次数增加(P＜0.05)；二者组间比较差异显著(P＜0.05)(见表3)。

(3)中央格停留时间

第1 天时,各组大鼠中央格停留时间无统计学差异(P＞0.05)。 第8、15、22、29 天时,与假手术组、卒中组比较,PSD 组大鼠中央格停留时间逐渐延长(P＜0.05)；与PSD 组比较,FLU 组与联合治疗组大鼠中央格停留时间缩短(P＜0.05)；二者组间比较差异显著(P＜0.05)(见表4)。

表1 PCR 引物序列Table 1 PCR primer sequence

表2 各组大鼠水平运动得分比较(±s, n=10)Table 2 Comparisons of horizontal movement scores of rats in each group

表2 各组大鼠水平运动得分比较(±s, n=10)Table 2 Comparisons of horizontal movement scores of rats in each group

注:与假手术组比较,*P＜0.05；与卒中组比较,#P＜0.05；与PSD 组比较,●P＜0.05；与FLU 组比较,△P＜0.05。Note. Compared with the sham operation group, *P＜0.05. Compared with the stroke group, #P＜0.05. Compared with the PSD group, ●P＜0.05.Compared with the FLU group, △P＜0.05.

组别Groups水平运动得分(分)Horizontal movement score(score)1 天1 d 8 天8 d 15 天15 d 22 天22 d 29 天29 d假手术组Sham operation group 45±4.4 50.3±5.79 63.2±6.09 68±4.67 72.1±6.01卒中组Stroke group 39.1±4.77* 48±5.46 60.3±3.77 65.8±5.61 70±5.25 PSD 组PSD group 38±4.32* 35.1±4.82*# 31.8±5.81*# 28.2±5.27*# 25±4.85*#氟西汀组Fluoxetine group 38.2±3.82* 44.8±2.53● 51.9±4.48● 57.7±5.93● 60.9±4.7●联合治疗组FLU+FTY720 group 38.1±4.51* 45.1±2.47● 56.5±3.14●△ 65±5.08●△ 67.1±4.86●△

2.2 蔗糖水消耗实验

第1 天时,造模的四组大鼠与假手术组大鼠相比蔗糖水消耗比例降低(P＜0.05)。 第8、15、22、29天时,与假手术组、卒中组比较,PSD 组大鼠蔗糖水消耗比例明显下降(P＜0.05)；与PSD 组比较,FLU组与联合治疗组大鼠蔗糖水消耗比例升高(P＜0.05)；二者组间比较差异具有统计学意义(P＜0.05)(见表5)。

2.3 海马中5-HT、NE、DA 含量

与假手术组、卒中组比较,PSD 组大鼠海马中5-HT、NE、DA 的含量显著降低(P＜0.05)；与PSD组比较,FLU 组与联合治疗组大鼠海马中5-HT、NE、DA 的含量升高(P＜0.05)；二者组间比较差异显著(P＜0.05)(见图1)。

2.4 海马中TPH2 mRNA、TH mRNA 表达

与假手术组、卒中组比较,PSD 组大鼠海马中TPH2 mRNA、TH mRNA 的表达水平显著降低(P＜0.05)；与PSD 组比较,FLU 组与联合治疗组大鼠海马中TPH mRNA、TH mRNA 的表达量均升高(P＜0.05)；二者组间比较差异具有统计学意义(P＜0.05)(见图2)。

3 讨论

PSD 是脑卒中后最常见的情绪障碍,是危害社会和公共卫生的严重问题。 然而目前针对PSD 的治疗药物较少且具有局限性,因此为PSD 探索新的治疗途径至关重要。

表3 各组大鼠垂直运动得分比较( ±s, n=10)Table 3 Comparisons of vertical movement scores of rats in each group

表3 各组大鼠垂直运动得分比较( ±s, n=10)Table 3 Comparisons of vertical movement scores of rats in each group

注:与假手术组比较,*P＜0.05；与卒中组比较,#P＜0.05；与PSD 组比较,●P＜0.05；与FLU 组比较,△P＜0.05。Note. Compared with the sham operation group, *P＜0.05. Compared with the stroke group,#P ＜0.05. Compared with the PSD group, ●P ＜0.05.Compared with the FLU group, △P＜0.05.

组别Groups垂直运动得分(分)Vertical movement score(score)1 天1 d 8 天8 d 15 天15 d 22 天22 d 29 天29 d假手术组Sham operation group 12.1±3.73 14.1±3.64 16.1±2.92 17±2.79 18.1±3.84卒中组Stroke group 8.5±2.84* 13±3.3 14.9±3.25 15.6±3.1 16.1±2.69 PSD 组PSD group 8±1.94* 7.6±2.55*# 7±2.31*# 6±2.36*# 5.2±1.87*#氟西汀组Fluoxetine group 8.2±1.93* 11.1±1.91● 12±2.58● 12.5±2.59● 13.5±2.64●联合治疗组FLU+FTY720 group 8.1±2.03* 11.3±2.21● 14.5±1.43●△ 15.0±2.31●△ 16.4±3.72●△

表4 各组大鼠中央格停留时间比较( ±s, n=10)Table 4 Comparisons of central grid stay time of rats in each group

表4 各组大鼠中央格停留时间比较( ±s, n=10)Table 4 Comparisons of central grid stay time of rats in each group

注:与假手术组比较,*P＜0.05；与卒中组比较,#P＜0.05；与PSD 组比较,●P＜0.05；与FLU 组比较,△P＜0.05。Note. Compared with the sham operation group, *P＜0.05. Compared with the stroke group,#P ＜0.05. Compared with the PSD group, ●P ＜0.05.Compared with the FLU group, △P＜0.05.

组别Groups中央格停留时间(s)Central grid stay time 1 天1 d 8 天8 d 15 天15 d 22 天22 d 29 天29 d假手术组Sham operation group 0.81±0.47 1.02±0.36 1.81±0.4 4.52±0.56 5.5±0.77卒中组Stroke group 0.81±0.42 0.93±0.38 1.93±0.65 5.2±0.58 7±1.06 PSD 组PSD group 0.9±0.37 4.02±0.8*# 7.07±0.89*# 12.18±0.93*# 14.03±1.17*#氟西汀组Fluoxetine group 0.89±0.37 2.4±0.65● 4.5±0.78● 8.82±0.91● 11.05±1.11●联合治疗组FLU+FTY720 group 0.81±0.43 0.95±0.38●△ 2±0.65●△ 5.71±0.82●△ 8.5±0.97●△

表5 各组大鼠蔗糖水消耗比例比较( ±s, n=10)Table 5 Comparisons of volume ratio of sucrose water consumption of rats in each group

表5 各组大鼠蔗糖水消耗比例比较( ±s, n=10)Table 5 Comparisons of volume ratio of sucrose water consumption of rats in each group

注:与假手术组比较,*P＜0.05；与卒中组比较,#P＜0.05；与PSD 组比较,●P＜0.05；与FLU 组比较,△P＜0.05。Note. Compared with the sham operation group, *P＜0.05. Compared with the stroke group, #P＜0.05. Compared with the PSD group, ●P＜0.05.Compared with the FLU group, △P＜0.05.

组别Groups蔗糖水消耗比例(%)Volume ratio of sucrose water consumption 1 天1 d 8 天8 d 15 天15 d 22 天22 d 29 天29 d假手术组Sham operation group 66±13.78 69.6±10.56 75.3±12.53 84.3±15.71 89.7±15.9卒中组Stroke group 53.7±10.14* 63.3±13.38 69.6±12.15 79.5±14.85 83.7±14.24 PSD 组PSD group 52.5±11.94* 46.5±12.43*# 42.6±8.46*# 36.9±8.95*# 31.2±8.85*#氟西汀组Fluoxetine group 51±12.33* 57±10.77● 61.5±11.94● 65.4±14.82● 69±17.49●联合治疗组FLU+FTY720 group 54±13.42* 67.5±5.52●△ 72.3±11.53●△ 78±10.95●△ 82.5±13.87●△

注:与假手术组比较,*P＜0.05；与卒中组比较,#P＜0.05；与PSD 组比较,●P＜0.05；与FLU 组比较,△P＜0.05。图1 大鼠海马中单胺类神经递质含量比较Note. Compared with the sham operation group, *P＜0.05. Compared with the stroke group, #P＜0.05. Compared with the PSD group, ●P＜0.05.Compared with the FLU group, △P＜0.05.Figure 1 Comparison of the content of monoamine neurotransmitters in the hippocampus of rats

注:与假手术组比较,*P＜0.05；与卒中组比较,#P＜0.05；与PSD 组比较,●P＜0.05；与FLU 组比较,△P＜0.05。图2 大鼠海马中单胺类神经递质合成限速酶表达量比较Note. Compared with the sham operation group, *P ＜0.05. Compared with the stroke group, #P ＜0.05. Compared with the PSD group, ●P ＜0.05.Compared with the FLU group, △P＜0.05.Figure 2 Comparison of the expression levels of rate-limiting enzymes in the synthesis of monoamine neurotransmitters in the hippocampus of rats

本实验在应用线栓法制备MCAO 模型的基础上加用CUMS 法结合孤养法制备PSD 大鼠模型。 该模型的制备原理是锯齿类动物经过CUMS 应激之后出现活动能力下降、兴趣丧失、缺乏探索等一系列抑郁样表现[12-13],较好的模拟了临床上PSD 的核心症状。同时孤养法也模拟了病人患病后住院时的孤独状态,因此该模型在PSD 的相关研究中广泛应用[14]。

实验大鼠模型的成功制备是相关行为学指标测定的前提。 旷野实验水平运动反映大鼠的运动活动性水平；垂直运动反映大鼠对新鲜环境的好奇程度[15]；中央格停留时间反映大鼠启动活动的潜伏期[16]；蔗糖水消耗实验反映了大鼠对奖赏后的快感反应[17]。 本实验结果显示,与假手术组、卒中组比较,PSD 组大鼠旷野实验得分及蔗糖水消耗比例明显下降,提示PSD 模型造模成功。 与PSD 组比较,FLU 组及联合治疗组大鼠行为学得分升高,二者进一步比较发现联合治疗组疗效更显著,证实FTY720可明显改善PSD 大鼠的抑郁样行为。 目前免疫抑制剂在治疗PSD 方面的研究较少,有少量报道显示FTY720 可以改善单纯抑郁样行为[18],PSD 作为一种特殊的抑郁类型,本实验已证实FTY720 对PSD同样具有确切的疗效,为PSD 的治疗提供新思路。

前文已证实FTY720 对PSD 大鼠的抑郁样行为具有改善作用,本研究的另一核心是进一步观察这种改善作用是否与单胺类神经递质有关。 结果发现,PSD 组大鼠海马中5-HT、NE、DA 含量明显降低,FLU 组与联合治疗组大鼠海马中5-HT、NE、DA的含量升高,进一步比较发现,联合治疗组大鼠海马中5-HT、NE、DA 的含量升高更显著, 证实FTY720 对PSD 大鼠行为学的改善作用是通过提高单胺类神经递质水平实现的。 单胺类神经递质是一类具有广泛生物学活性的物质,其中5-HT、NE、DA 与抑郁症关系最为密切。 目前有理论研究表明,卒中后中枢及外周发生的炎症反应将继发一系列改变[19-20],不仅过度激活IDO 酶,导致色氨酸(5-HT 的前体)被降解,分解成的喹啉酸及犬尿酸抑制DA 的释放[21],而且会过度激活HPA 轴,使皮质醇过量分泌[5,22],进一步诱导降解酪氨酸(NE 的前体)[23]。 由此可见单胺类神经递质减少的根源在于炎症反应的激活,本次研究也通过动物实验证实抗炎后可以提高单胺类神经递质的含量,为上述理论研究提供了可行性。

为了进一步探究FTY720 提高单胺类神经递质含量的机制,本次实验还发现FTY720 可以调控单胺类神经递质合成限速酶的表达。 结果提示,PSD组大鼠海马中THP2 及TH mRNA 表达量显著下降,与PSD 组比较,FLU 组及联合治疗组大鼠海马中THP2 及TH mRNA 表达量升高,二者进一步比较发现,联合治疗组大鼠海马中THP2 及TH mRNA 表达升高更显著。 TPH2 与TH 属芳香族氨基酸羟化酶家族,分别负责5-HT 及儿茶酚胺类神经递质(NE、DA)合成的最初步骤[24],是催化5-HT、NE、DA 合成的限速酶。 目前国内在FTY720 对单胺类神经递质合成限速酶表达方面的作用尚无报道,本实验证实了FTY720 在调控单胺类神经递质合成限速酶表达方面的有效性,进而也证实了FTY720 可通过此途径来提升单胺类神经递质的水平。

综上所述,FTY720 对PSD 大鼠的抑郁样行为具有明显改善作用,其作用机制为通过调控海马组织中单胺类神经递质合成限速酶的表达来提高单胺类神经递质的水平,进而改达到治疗效果。 本次研究不仅为PSD 的治疗提供了新的方向,也为单胺类神经递质学说提供了重要的补充。