左旺盛张 钰张 玲秦 川

(中国医学科学院医学实验动物研究所,北京协和医学院比较医学中心,北京 100021)

糖尿病作为一种慢性疾病可以引起多器官的损伤,主要是影响肾、视网膜以及周围神经系统[1]。如果对糖尿病不进行干预,长久以往可能会导致神经系统损伤,出现认知功能损害,临床主要表现为学习、记忆功能下降,最终导致痴呆。 有研究显示糖尿病的认知障碍原因是由于脑海马区的线粒体功能失调导致脑部能量供应障碍[2],也有研究显示是由于突触相关的信号传导障碍,导致认知问题的出现[3]。 目前对于糖尿病认知障碍没有理想的治疗方法。 丁苯酞(N-butylphthalide,NBP)具有多靶点的保护作用,如线粒体保护作用、抗神经细胞凋亡等,目前是神经内科的一线用药,主要用于中风脑梗的临床治疗[4]。 突触素(synaptophysin,SYN)是一种特异性钙结合蛋白,通过调节突触的分化和生长影响突触结构,是影响突触功能的重要指标[5]。 突触后致密物95(postsynaptic density 95,PSD-95)是突触后膜致密区上一种支架蛋白,能激发突触的活性,参与突触的连接和维持,增强突触重塑[6]；研究显示,抑制小鼠PSD-95 的表达会出现学习障碍,突触缺失[7]。 线粒体是人体能量的生产工厂,海马线粒体结构的大量损坏会影响大脑的能量供应,对认知功能有着一定的影响,认知障碍的小鼠线粒体内容物以及嵴结构不清,线粒体形态改变以及裂变增多[8]。 本研究采用db/db 小鼠作为糖尿病模型,旨在探讨NBP 对糖尿病小鼠海马线粒体结构,SYN、PSD-95 表达量以及认知功能的影响。我们在13 周龄时检测到糖尿病小鼠认知障碍,从上述各指标的检测结果显示,NBP 通过缓解了海马突触相关蛋白SYN、PSD-95 的表达下降和改善线粒体结构从而达到治疗db/db 小鼠的认知功能障碍的效果。

1 材料和方法

1.1 实验动物

db/db 小鼠(C57BL/KsJ)是Leptin 受体点突变的II 型糖尿病小鼠,出生后6 周即可出现明显的肥胖和高血糖等糖尿病症状,8 ～12 周时最明显,并可出现糖尿病肾病等并发症。 本研究采用了20 只5周龄SPF 级雄性糖尿病模型db/db 小鼠体重40 ～43 g,以及5 只同窝出生db/m 雄性小鼠23 ～25 g,均购自江苏集萃药康生物科技有限公司[SCXK(苏)2018-0008],饲养于中国医学科学院医学实验动物研究所动物房[SYXK(京)2019-0014]。 饲养期间自由饮水饮食,温度(24±1)℃,(12/12)h(光照/黑暗)常规饲养。 所有动物实验均经中国医学科学院医学实验动物研究所动物实验伦理委员会审核并批准(IACUC-QC19024)遵循3R 原则。

1.2 主要试剂与仪器

NBP 注射液浓度5 mg/mL(石药集团恩必普药业有限公司)；兔单克隆抗体SYN、兔多克隆抗体PSD-95、β-actin(美国abcam 公司,货号分别为ab32127、ab18258、ab21058)；二抗羊抗兔(中国中杉金桥公司,ZB-2301)。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组及给药处理

将20 只db/db 小鼠采用随机数字表法分为模型组,低、中、高剂量NBP 治疗组,以上每组数量均为5 只。 适应性喂养一周后,NBP 注射液按照20、40、60 mg/(kg·d)分别注射给低、中、高剂量治疗组；同窝对照组5 只(正常组)和模型组给予同等体积的生理盐水腹腔注射,以上各组处理均为6 周。每周进行一次体重测量以及空腹尾静脉血糖测量。

1.3.2 小鼠学习和空间记忆能力检测

Morris 水迷宫实验测试期:将小鼠分别从三个象限头朝池壁放入水迷宫,自由游行,计时60 s,期间找到平台时追踪器自动停止计时,记录时间为逃逸潜伏期,超过60 s 的记录为60 s,将小鼠引导至平台停留15 s；每个象限实验间隔20 min 后再进行下一个象限,共训练5 d；探索期:第6 天撤除平台,将四小鼠从第二象限放入池中,记录60 s 小鼠穿越平台区的次数[9]。

1.3.3 实验取材

水迷宫实验结束后解剖取材,每组选取3 只小鼠迅速剪下头颅,迅速取出海马置于冻存管于液氮中,置于-80℃冰箱中冻存。 两只小鼠用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline, PBS)灌注,多聚甲醛灌注后取出海马置于4%多聚甲醛,用于电镜观察。

1.3.4 Western blot 检测小鼠海马组织SYN、PSD-95 蛋白表达量

取出冻存海马称量,提取总蛋白；BCA 试剂盒测量蛋白浓度,配平后在沸水中煮5 min；取20 μg的蛋白进行凝胶电泳,湿转法将分离的蛋白转至PVDF 膜上；配5%的奶粉封闭1 h 后,分别加SYN、PSD-95,β-tubulin 一抗4℃过夜；羊抗兔二抗孵育1 h；加ECL 发光液后于凝胶成像,检测条带灰度值并分析。

1.3.5 透射电镜观察海马区线粒体结构变化

将剥离出的海马组织置于4%多聚甲醛,其后标本采用不同浓度梯度乙醇进行脱水处理,经环氧树脂包埋后修块,采用柠檬酸铅染色制片后于透射电镜下观察[10]。

1.4 统计学方法

所有数据采用SPSS 26.0 软件进行统计学分析,计量数据均采用平均数±标准差(±s)表示,多组间比较行双因素方差分析,两两比较应用t检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

注:与正常组相比,**P＜0.01；与模型组相比,各治疗组,P＞0.05。图1 各组小鼠体重(a)、血糖(b)比较( ±s)Note. Compared to the normal group, **P＜0.01. Compared with model group, each treatment group, P＞0.05.Figure 1 Comparison of body weight (a) and blood glucose (b) in each group

2 结果

2.1 NBP 对db/db 小鼠体重和血糖变化无显著差异

各组与正常组相比,模型组和各个治疗组小鼠血糖及体重明显升高,差异有统计学意义(P＜0.01)；模型组与各个治疗组以及组间体重跟血糖比较差异无统计学意义(P＞0.05)。 (图1)

2.2 NBP 改善了db/db 小鼠空间学习与记忆能力的障碍

模型组与正常组相比,水迷宫逃逸潜伏时间显著增加,穿越平台次数显著减少,P＜0.01,说明13周龄时db/db 小鼠相对于正常组小鼠已经出现严重认知障碍,糖尿病认知障碍模型造模成功；各剂量NBP 治疗组与模型组相比,低剂量治疗组逃逸潜伏时间下降,穿越平台的次数提高,P＜0.05；中剂量治疗组小鼠逃逸潜伏期相对与模型组有改善,P＜0.05,且改善效果比低剂量要好；高剂量治疗组相对于模型组小鼠逃逸潜伏期下降,P＜0.05,且效果优于低剂量和中剂量治疗组。 (图2)

2.3 NBP 缓解了db/db 小鼠海马组织中SYN、PSD-95 蛋白表达量的下降

模型组与正常组相比,海马中SYN 与PSD-95蛋白相对表达含量显著降低(P＜0.01)；各治疗组与模型组相比,海马中SYN 与PSD-95 蛋白相对表达含量均有所提高(P＜0.05),且高剂量NBP 治疗组效果较低剂量组、中剂量组好。 (图3)

2.4 NBP 降低了db/db 小鼠海马区线粒体结构的损伤

正常组的线粒体结构正常,多呈椭圆形,嵴结构清晰并且排列紧密,膜结构完整；模型组线粒体受损,嵴结构稀疏,融合,膜结构损坏,逐渐空泡化,且体积在同样倍数下显著增大；各剂量治疗组海马线粒体大部分结构完整,嵴结构有少量破坏,但相对与模型组要正常,膜结构也相对组完整。 (图4)

注:a:逃逸潜伏期。 与模型组相比,低剂量组*P ＜0.05,**P ＜0.01；中剂量组,#P ＜0.05,##P ＜0.01；高剂量组,$$P＜0.01, $$$P＜0.001。 b:穿台次数。 与正常组相比,**P＜0.01；与模型组相比,##P＜0.01。图2 各组小鼠水迷宫实验学习记忆成绩比较( ±s)Note. a, Escape lantency. Compared with Model group, Low group *P ＜0.05, **P ＜0.01. Medium group, #P ＜0.05,##P＜0.01. High group, $$P ＜0.01, $$$P ＜0.001. b, The number of crossing-platform. Compared with normal group,**P＜0.01. Compared with the model group, ##P＜0.01.Figure 2 Results of learning and memory in water maze experiment were compared among all groups

注:与正常组相比,**P＜0.01；与模型组相比,各治疗组,#P＜0.05。图3 各组小鼠海马PSD-95、SYN 表达量比较(±s)Note. Compared with normal group **P＜0.01. Compared with model group, each treatment group, #P＜0.05.Figure 3 Comparison of the expressions of PSD-95 and SYN in the hippocampus of mice in each group

3 讨论

2017 年我国糖尿病患者已达到1.14 亿,成为全球患病人数最多的国家[11]。 糖尿病并发症影响肾、视网膜、神经和心血管系统,是糖尿病发病和死亡的主要原因[12]。 然而糖尿病发展到后期,患者不只是会出现以上并发症,也会产生认知功能的损伤,主要表现在学习记忆能力的下降[13]。 目前临床治疗糖尿病措施主要是胰岛素注射和口服降糖药,不能解决糖尿病患者后期出现的认知功能损伤。NBP 是我国已批准用于治疗缺血性脑卒中的合成化合物,主要从芹菜籽中提取。 它具有多种生物学作用,最主要是临床上用于改善脑梗死的预后[14],有研究表明NBP 能抑制神经元凋亡,具有神经保护作用[15],具有抗氧化和减轻线粒体功能障碍的神经保护作用[16]。 本研究发现db/db 小鼠在第13 周检测时认知功能已经严重受损,表现为db/db 小鼠与对照组相比,水迷宫潜伏明显延长,测试期穿越平台次数显著下降。

注:红色箭头表示线粒体结构。图4 各组小鼠海马线粒体结构电镜图Note. The red arrows indicate the mitochondrial structure.Figure 4 Electron micrograph of mitochondrial structure in hippocampus of mice of each group

SYN、PSD-95 能影响突触的结构和功能,是研究突触的重要指标[17],PSD-95 作为重要的骨架蛋白,是突触敏感的结构指标[18],PSD-95 的表达减少说明突出后致密物质变薄,突触活性降低,最终导致突触传导发生障碍[19]。 SYN 是突触小泡上的膜蛋白,与神经递质的释放,突触形成及突触小泡上离子通道密切相关,是突触功能的标志蛋白[20]。SYN 可以通过调节轴突和树突的分化和生长,影响突触结构[13],SYN 常用来检测突触的密度和分布,其数量减少表明突触数量减少,囊泡减少,从而影响神经递质的释放,影响信号传导[21]。 突触承担了传递信号的重要作用,认知障碍可能是由突触功能障碍引起的,神经退行性变的认知障碍会发生明显的广泛突触丢失[22],SYN、PSD-95 能显著影响突触的结构和功能,故本研究检测SYN、PSD-95 的表达情况来观察糖尿病认知障碍是否与突触相关蛋白有联系。 实验检测发现模型组SYN、PSD-95 的表达量相对于正常组严重降低,而NBP 治疗组相对于模型组蛋白表达量的下降有所改善。

线粒体是体内最重要的能源中心,90%的三磷酸腺苷(ATP)由线粒体提供[23]。 线粒体结构和功能的改变,是细胞程序化死亡的关键性环节。 糖尿病小鼠体内由于长期的高血糖而产生氧化损伤,导致线粒体结构的氧化损伤,膜结构破坏,线粒体DNA 破坏,进而造成线粒体功能异常,ATP 含量降低[24]。 有研究表明线粒体内产生的ROS 增多可将自身作为首要靶目标导致线粒体损伤,包括对呼吸链及内外膜及基质蛋白的影响,导致ROS 产生更多,ATP 合成减少,进而线粒体膜通透性改变启动线粒体凋亡途径诱导细胞凋亡的发生[25]。 动物实验发现,NBP 能显著提高Na+/K+-ATP 酶和Ca2+-ATP 酶活性,保证正常的线粒体膜电位,从而维持线粒体的结构和功能[26],NBP 通过增强线粒体膜电位和增加线粒体呼吸链复合体I-IV 和ATPase 的活性来减轻线粒体功能障碍,NBP 改变了调节线粒体融合和分裂的蛋白质平衡[16]。

本研究发现模型组以及给药组db/db 小鼠的体重和血糖一直保持很高的水平,符合糖尿病的指标。 三个剂量的NBP 治疗组对于db/db 小鼠的血糖和体重无改善作用,原因可能是由于NBP 不参与小鼠体内的糖代谢和脂代谢的过程。 NBP 对于海马线粒体结构损伤有着很大的改善,对于海马SYN、PSD-95 的表达降低有提高作用,NBP 可能通过改善线粒体结构损伤,从而改善脑部的能量供应,减少神经细胞的凋亡方面起作用,改善海马突触的神经递质释放以及传导功能等方面改善db/db小鼠的认知障碍,且不同剂量的NBP 对db/db 小鼠的认知改善效果不同,本研究区间内高剂量治疗组的改善效果优于低剂量跟中剂量组。

综上所述,我们的结果提示丁苯酞可能通过提高糖尿病小鼠海马内SYN、PSD-95 的表达,改善海马突触的功能以及线粒体功能,从而改善了db/db小鼠的认知功能障碍。 因此,本研究为丁苯酞改善糖尿病相关的认知功能损害提供了参考,可作为潜在治疗策略。