雷梓 陈建功 何颖 李睿 吴莹莹★

胶质瘤是最常见的原发性脑部肿瘤之一，呈浸润性生长，恶性程度高，其中胶质母细胞瘤具有更高的复发率、致残率、死亡率，严重威胁着人类健康［1］。异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）突变是胶质瘤发生发展中重要的分子事件并且可作为分子分型的依据［2］。IDH1 最常见的突变是R132H，占所IDH 突变的80%。有研究显示IDH1 突变是胶质瘤发生过程中的早期事件，在胶质瘤的进展以及复发过程中也起到了重要作用［3］。TET 家族蛋白（ten-eleven translocation protein family，TETs）是一种依赖α-酮戊二酸和Fe2+而发挥催化活性的双加氧酶。TETs 是催化DNA去甲基化过程中的第一步，可将5-甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5mc）转化为5-羟甲基胞嘧（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）非甲基化形式［4］。TET 蛋白介导的DNA 脱甲基化在胶质瘤中起到非常重要的作用［5］。本研究拟探讨TEF1 介导的5-羟甲基胞嘧（5hmC）表达对异柠檬酸脱氢酶1（IDH1）突变的U251 胶质瘤细胞生物学行为的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞和主要试剂

人胶质瘤细胞U251 购自武汉普诺赛公司；胎牛血清（FBS）购自Gibco 公司；Trziol 试剂盒、逆转录试剂盒购自Invitrogen 公司；IDH1-R132H 突变质粒及TET1 过表达质粒由汉恒生物公司合成；CCK-8 试剂盒、凋亡检测试剂盒购自东仁化学公司；细胞周期检测试剂盒购自七海生物公司；Transwell 小室、Matrigel 基质胶购自美国Corning 公司；IDH1 抗体、TET1 抗体、5hmC 抗体购自Abcam公司。

1.2 细胞培养与转染

U251 细胞使用含10% FBS 的DMEM（H）培养基置于37℃、5% CO2培养箱培养。按照Lipofectamine 2000 转染试剂盒说明书，细胞融合度达到50%时，IDH1R132H突变质粒及阴性对照质粒转染细胞，转染6 h 后更换新鲜培养基，继续培养48 h，收集细胞检测IDH1、TET1 表达水平。细胞转染IDH1-R132H 质粒48 h 后，继续转染TET1 过表达质粒及过表达对照质粒，转染48 h 用于后续检测5hmC 表达水平及进行功能实验。……