张拔山 李荣 王文锋 周雪明 罗北京 朱梓年 张锡波 丁爱娇

成骨不全（Osteogenesis Imperfecta，OI）是一组遗传性结缔组织疾病，其特点是儿童早期骨脆性增加、骨量减少和骨折频繁［1］。目前认为大约90%的OI 病例是由col1a1 和col1a2 的常染色体显性突变引起的。然而，大约20%～25%的中度至重度OI 患者在其他基因中存在致病性突变［2］。突变如SERPINF1、P3H1、CRTAP、PPIB、BMP1、FKBP10、SP7、PLOD2、TMEM38B、PLOD2、P4HB、SPARC 和SEC24 等被认为与常染色体隐性OI 病例密切相关［3］。此外，研究表明WNT1突变影响成骨细胞活性，导致OI 患者骨量紊乱、脆性骨折和进行性骨异常［4］。WNT1是Wnt 蛋白家族的一员，在调节骨量和维持骨代谢的动态平衡方面起着重要作用。体外实验表明，WNT1缺陷可导致骨形成显著减少，而WNT1过度表达可促进骨形成［5］。在OI 中，研究表明WNT1的双等位基因突变导致隐性OI，而WNT1杂合子突变与显性遗传家族中的早发性骨质疏松症相关［6］。目前为止，已超过27 种导致WNT1突变的疾病［7］。然而，大多数WNT1突变的生物学功能尚未阐明。典型的WNT1通路通过与细胞表面的frizzle 和LRP5 受体结合来启动信号级联，导致非磷酸化β-catenin在细胞中的积累，并作为转录因子来刺激WNT信号通路下游靶基因的转录［8］。因此，本研究构建 了WNT1野 生 型、WNT1c.110T＞C、WNT1c.505G＞T 和WNT1c.884C＞A 突变质粒（阳性对照），并将其转染成骨细胞（MC3T3-E1），研究突变对MC3T3-E1 细胞中WNT1/β-catenin 通路激活的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

在添加10%胎牛血清的α-DMEM 中培养成骨前细胞（MC3T3-E1）。细胞在37℃的培养箱中在5%的二氧化碳和90%的湿度下生长。

1.2 质粒构建与转染

利用通用生物系统公司（General Biosystems，Inc。）合成野生型WNT1、突变型WNT1c.110T＞C、WNT1c.505G＞T 和WNT1c.884C＞A 质粒，以空质粒（载体）为阴性对照，c.884C＞A 为阳性对照。为研究突变对MC3T3-E1 细胞的影响，在转染前将细胞以5×105的密度接种到6孔板中并培养24小时。……