林了一 余 烨 程杰军 张 凤 傅奕铖 吴华伟

肺癌是世界范围内肿瘤相关死亡的首要原因之一［1］，肿瘤中乏氧细胞产生是晚期非小细胞肺癌放疗抵抗的重要原因。肿瘤乏氧微环境能够维持低氧状态，导致肿瘤组织血供异常，并产生乏氧细胞，从而引起相关肿瘤生物学特性的改变，影响肿瘤的发生发展［2］。能谱CT 成像是一种以瞬时双能切换为核心的双能量CT 成像技术，能够获取病灶的单能量CT 值、碘浓度以及能谱曲线斜率等多项定量参数，在客观评估病变的组织特性及功能状态方面具有较大的应用潜力［3-4］。本研究拟建立兔VX2 肺移植瘤模型并进行能谱CT 成像，探讨肺癌乏氧区域的能谱CT 成像特点，分析能谱CT定量参数在肿瘤不同乏氧情况下的差异。

方 法

1. 动物模型建立

实验动物为清洁级新西兰大白兔，雌雄不限，体重2～3 kg。在CT 扫描定位下行肺穿刺种植VX2 肿瘤，并在种植肿瘤2 周后进行常规CT 扫描检查，观察肿瘤生长情况。取种植成功、肿瘤生长合适的实验兔进行能谱CT成像。

2. 能谱CT检查

采用宝石能谱CT 仪（Discovery CT 750 HD，GE Healthcare，Milwaukee，USA）对实验兔进行CT扫描，先平扫确定肿瘤部位和范围，再对肿瘤行能谱CT 增强扫描。主要扫描参数：管电压为80 keV 和140 keV（0.5 ms 瞬时切换），管电流为260 mA，层厚和间隔均为5 mm。对比剂应用碘帕醇（含碘量370 mg／ml），采用高压注射器行兔耳缘静脉注射，流速1 ml／s，总量5 ml，随后注射2 ml 生理盐水，流速1 ml/s。动脉期扫描应用CT 监测主动脉，主动脉CT值达到100 HU时自动触发扫描，静脉期扫描设置为动脉期扫描开始后延迟20 s自动采集。

3. 能谱CT参数测量

由2 位从事肺部影像诊断多年的医师共同阅片后获得一致意见，测量能谱CT 参数。选择肿瘤的最大横截面及上下2 个层面，感兴趣区（region of interest，ROI）面积接近肿瘤面积的2/3，最后取平均值。选择70 keV 是由于单能量70 keV 与传统120 kV 峰值扫描图像能量相近；其次，能谱CT 双能量瞬时切换产生单能量图像，相对传统CT 模式不会产生混合能量CT 图像，模拟120 kV 峰值的同时能够提供更准确的单能量CT 值［5］。测量能谱CT 定量参数70 keV CT 值、 标准 化 碘 浓 度（normalized iodine concentrations，NIC），通过40 keV 及100 keV 单能量CT值计算能谱曲线斜率λHU。

4. 肿瘤组织免疫组织化学检测

能谱CT成像检查结束后，处死动物前2 h将乏氧探针哌莫硝唑（60 mg／kg）通过耳缘静脉注射入实验兔体内，处死动物后取出其肺肿瘤组织，采用免疫组织化学二步染色法进行肿瘤乏氧探针染色，低氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor-1 alpha，HIF-1α）染色，以及微血管密度（microvessel density，MVD）测量的CD31染色。乏氧探针染色及HIF-1α染色阳性率判读，以阳性着色强度和阳性细胞占总细胞数的百分比乘积进行半定量处理［6］。依据乏氧评分对肿瘤的乏氧程度进行分组，染色结果≤3 分为弱乏氧组，染色程度＞3 分为强乏氧组。MVD 计数：利用CD31 单克隆抗体标记肿瘤微血管，呈棕褐色或棕黄色，按照Weldner等［7］的评估标准进行计数。

5. 统计学分析

数据统计分析采用专业统计软件SPSS 24.0 以及MedCalc 12.0进行，连续变量用平均值±标准差表示。采用独立样本t 检验、非参数检验比较连续变量的差异。 采用受试者操作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲线分析比较能谱CT 定量参数对VX2 肿瘤组织内乏氧程度的预测准确性，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

用30只新西兰大白兔建立VX2肺移植瘤模型，2周后行肿瘤CT 平扫检查发现肺内出现结节病灶为有效模型，最后纳入22 只成功种植的实验兔（肿瘤25个），所有标本在实验中均经病理证实为肿瘤组织，肿瘤平均长径为（12.69±5.94）mm。依据乏氧探针染色结果分组：强乏氧组有实验兔11只，肿瘤14个；弱乏氧组有实验兔11只，肿瘤11个。

能谱CT 定量参数（图1）静脉期NIC、静脉期λHU在不同乏氧程度的兔VX2 肺移植瘤之间存在显著差异。强乏氧组的静脉期NIC高于弱乏氧组的静脉期NIC，强乏氧组的静脉期λHU同样高于弱乏氧组，差异有统计学意义（P＜0.05）。而动静脉期40 keV 及100 keV CT 值、动脉期70 keV CT 值、动脉期NIC、动脉期λHU和静脉期70 keV CT 值在强乏氧组和弱乏氧组之间差异没有统计学意义（P＞0.05，表1）。此外，肿瘤长径在不同乏氧程度分组之间差异没有统计学意义。

免疫组织化学检测发现VX2 肺移植瘤内MVD 和HIF-1α 水平在不同乏氧程度的兔之间均存在显著差异：强乏氧组的MVD 计数显著高于弱乏氧组（27.56±6.48 vs 20.35±4.68，P=0.012），强乏氧组的HIF-1α 表达显著高于弱乏氧组（4.13±1.50 vs 2.44±1.02，P=0.008）。

ROC 曲线分析显示，静脉期NIC 及静脉期λHU对预测兔VX2 肺移植瘤乏氧程度的AUC 分别为0.864，0.883。其中，静脉期λHU的曲线下面积（area under the curve，AUC）较高，诊断阈值为1.3，相应的灵敏度和特异度分别为85.7%和100%（表2、图2）。

讨 论

乏氧在实体肿瘤中普遍存在，实体肿瘤内乏氧细胞的产生导致肿瘤对放、化疗治疗的抵抗作用，影响 患者治疗及预后［8］。乏氧微环境改变会体现在肿瘤的血液供应及肿瘤微细结构的改变上。本研究结果显示：强乏氧组肿瘤组织的能谱CT 定量参数静脉期NIC 及静脉期λHU显著高于弱乏氧组，并且强乏氧组肿瘤组织在HIF-1α表达及MVD 计数上同样比弱乏氧组表现出更高水平。

表1 能谱CT定量参数及肿瘤长径在不同乏氧程度兔VX2移植瘤中的差异

表2 能谱CT定量参数预测兔VX2肺移植瘤乏氧程度的ROC曲线分析结果

图1 兔VX2肺移植瘤能谱CT图像A.动脉期70 keV CT图像（CT值为88.62 HU）；B.动脉期碘基物质图像（碘浓度为1.63 mg/cm3，标准化碘浓度为0.15）；C.动脉期能谱曲线（斜率为1.90）；D.静脉期70 keV CT图像（CT值为82.76 HU）；E.静脉期碘基物质图像（碘浓度为1.13 mg/cm3，标准化碘浓度为0.17）；F.静脉期能谱曲线（斜率为1.16）。

图2 静脉期NIC及静脉期λHU预测肿瘤乏氧程度的ROC曲线NIC为标准化碘浓度；λHU为能谱曲线斜率；VP为静脉期。

能谱CT 定量参数静脉期NIC 在不同乏氧程度肿瘤内部存在显著差异，这可能与肿瘤的血供改变有关。本研究结果显示，强乏氧组肿瘤内MVD 较弱乏氧组肿瘤内MVD 显著增高，其可能的原因是，乏氧会导致肿瘤内部生物学特性改变，促使肿瘤生长，导致肿瘤内部结构发生改变，乏氧微环境会导致肿瘤组织HIF-1α 及VEGF 的增多，并促使新生血管增多，以增加肿瘤的血液供应［9］。HIF-1α 在肿瘤内部乏氧微环境中同样有着重要作用，Fan 等［10］研究直肠癌中的乏氧情况，探究分子标志物HIF-1α 与能谱CT 碘浓度之间的相关性，发现直肠癌肿瘤组织内的HIF-1α表达与NIC具有显著的正相关性。

能谱曲线能够在一定程度上反映组织间的成分和结构的差异，能谱CT 定量参数静脉期λHU在不同乏氧程度肿瘤内部存在显著差异，这可能与不同乏氧程度肿瘤组织结构的差异有关。有研究表明，乏氧会影响细胞外基质的沉积、重组和降解，HIF-1α 表达升高能够诱导基质金属蛋白酶2 的表达，从而影响细胞外基质的生成和降解，导致细胞外基质重构，改变肿瘤微环境的结构特征，加剧癌症的转移［11-12］。这些均表明乏氧程度增加会影响肿瘤组织结构，并在能谱CT成像参数中有所体现。

ROC 曲线分析结果显示静脉期λHU区分肿瘤乏氧程度具有较好的诊断效能，AUC 为0.883，诊断阈值为1.3，灵敏度为85.7%，特异度为100%，而静脉期NIC 的AUC 为0.864，诊断阈值为0.17，灵敏度为78.6%，特异度为72.7%。由于HIF-1α升高会导致肿瘤细胞外基质重构，影响肿瘤内部结构，而肿瘤血管生成会促进肿瘤增生增殖，肿瘤内血管结构较紊乱，血管功能异常，紊乱的血管结构可能使得NIC在区分乏氧程度时效能降低。

本研究存在一定的不足之处。首先，研究样本较小，总体样本量有待进一步加大。第二，采用动物实验进行肿瘤成像研究，与人体自发肿瘤之间存在差别，有待进一步深入分析人体肿瘤乏氧程度来证实能谱CT 定量参数的应用价值。第三，尽管实验尽量保持动物标本与成像检测部位的一一对应关系，但误差依旧难以完全避免。

综上所述，能谱CT定量参数静脉期NIC及λHU可为预测肿瘤乏氧程度提供一定的参考，这对临床制订肿瘤个体化治疗方案及疗效评估具有潜在的指导意义。