冀玉良，李丹，罗嘉凡

（商洛学院生物医药与食品工程学院，陕西商洛 726000）

长期以来，在农业生产中一直靠使用化肥和农药以达到农作物快速生长和高产的目的，但是化肥和农药施用容易带来土壤肥力下降、连作障碍、农产品品质下降等一系列问题[1]。微生物肥料具有环境友好和低能耗的特点，故研发微生物肥料以部分替代化肥促进植物生长是农业可持续发展的必要途径[2-4]。乙烯在植物体内的正常生理功能是促进植物的成熟和衰老，但植物一生的大部分发育阶段只需要少量的乙烯。作为植物的一种自我保护反应[5-7]，植物在生长发育中遇到干旱、水涝、高盐、酸碱、重金属协迫和机械损伤、病原体入侵等不良环境因素时会产生过多的所谓“逆境乙烯”，过量乙烯会对植物生长产生抑制作用，进而导致植物生长发育停滞甚或死亡。1-氨基环丙烷-1-羧酸（简称为ACC）是植物体内生成乙烯的直接前体物质，在植物根际土壤中存在具有ACC脱氨酶活性的细菌，它能通过将ACC催化分解成α-丁酮酸和胺的方式降低植物在逆境环境下产生过多的乙烯，从而使植物体内乙烯保持在适量的水平，减少过量乙烯对植物生长发育产生的抑制和影响[8-9]。因此，近年来具有ACC脱氨酶活性的根际促生菌的研究日益受到了国内外学者的重视。根据目前的研究报道，从一种植物根际分离到的促生菌不仅能促进本植物的生长，而且对他种植物也会有促生作用[10-13]，如从豆科植物根际分离的促生细菌对非豆科植物也具有促生作用[14]。众所周知，连作障碍是困惑药用植物桔梗种植生产的一大难题[15-16]，本研究以ACC为唯一氮源，从豆科植物根际土壤中分离筛选出具有ACC脱氨酶活性的菌株，并测定其对桔梗的促生作用，以期为克服桔梗的连作障碍，研发桔梗的促生菌肥提供菌种资源。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 土壤及菌株来源

试验土壤样本来自商洛市杨斜镇大豆种植基地的根际土壤；作为对照用的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilus）由商洛学院生物医药与食品工程学院实验中心提供。

1.1.2 植物材料

市售桔梗（Platycodon grandiflorus）种子。

1.1.3 培养基

1）PAF富集培养基（g·L-1）

酪蛋白水解物10 g，蛋白胨10 g，K2HPO41.5 g，无水MgSO41.5 g，甘油10 mL，pH调至7.2。

2）DF盐筛选培养基（g·L-1）

组分 1：H3BO310 mg，ZnSO4·7H2O 124.6 mg，MnSO4·H2O 11.2 mg，MnO310 mg，CuSO4·5H2O 78.2 mg，分别称量以上药品溶解于100 mL无菌水中，-4°C冰箱保存。

组分 2：称量 FeSO4·7H2O 100 mg 溶于 10 mL无菌水，-4°C冰箱保存。

组分 1与组分 2溶液各取 0.1 mL，与MgSO4·7H2O 0.2 g，Na2HPO46 g，KH2PO44 g，(NH4)2SO42 g，柠檬酸 2 g，H2O 1 000 mL，葡萄糖2 g，葡萄糖酸2 g，混匀后pH调至7.2保存。

3）ADF加富培养基（g·L-1）

将ACC（1-氨基环丙烷-1-羧酸）用超纯水溶解，经抽滤灭菌后加入到预先灭菌的且不含(NH4)2SO4的DF盐培养基中，使添加ACC的终浓度为3.0 mmol·L-1，并调pH至7.2保存。

4）分离纯化培养基（g·L-1）

在ADF加富培养基培养液中加入琼脂（15～20 g·L-1），调 pH 至 7.2。

5）TSB培养基（g·L-1）

胰蛋白胨 17 g，大豆胨 3 g，NaCl 5 g，葡萄糖 2.5 g，K2HPO42.5 g，pH 调至 7.1。

1.2 方法

1.2.1 ACC脱氨酶活性菌的富集与分离

称取1 g大豆根际土壤样品加入50 mL无菌水，振荡制成土壤悬液，吸取悬液1 mL加入 50 mL PAF 培养液，在 28 °C，200 r·min-1下振荡培养。24 h后吸取1 mL振荡培养菌悬液重复转接PAF培养液中。培养好后再吸取菌悬液1 mL转至50 mL DF培养液中，相同条件培养24 h后从中吸取1 mL菌悬液加入50 mL ADF培养液中，在相同条件下培养24 h，用于ACC脱氨酶活性细菌筛选。ACC脱氨酶活性菌的分离用梯度稀释法，对ADF培养液中的菌悬液进行稀释，取0.1 mL稀释菌悬液涂布于ADF固体平板上，28°C下培养,待菌落长出后挑取单菌落反复纯化，最后根据菌落形态和颜色等挑取不同的单菌落保存于TSB培养基斜面。

1.2.2 ACC脱氨酶活性菌酶活力测定

酶的提取：将分离获得的菌株在TSB培养液中培养24 h，在4℃下离心收集菌体，菌体用不含(NH4)2SO4的DF培养液洗涤离心2次后，悬浮于ADF培养液中,于28℃振荡培养24 h。诱导菌株产生ACC脱氨酶后，于4℃离心收集菌体，菌体用Tris-HCl缓冲液（浓度为0.1 mol·L-1，pH 7.6）洗涤离心2次。再悬浮于 600 μL，pH为8.0的 0.1 mol·L-1Tris-HCl缓冲液中，接着往其中加入30 μL甲苯，迅速振荡 30 s使细胞破碎释放出脱氨酶。取含甲苯的细胞提取物 200 μL, 并加入浓度为 0.5 mol·L-1的 ACC 20 μL 混匀。

ACC脱氨酶的活力测定参考宋金秋等[17]的方法。酶活力大小用酶活力单位表示，每分钟ACC脱氨酶催化生成1 μmol α-丁酮酸的量定义为1个酶活力单位。以牛血清白蛋白为标准蛋白，用Bradford法测定总蛋白含量，ACC脱氨酶比活力计算公式为:

1.2.3 ACC脱氨酶活性菌对桔梗的促生试验

平皿促生试验参照黄盖等[18]的方法，挑取大小一致、饱满均匀、健康无病害的桔梗种子按以下步骤进行消毒处理：浸于70%酒精中5 min，然后10%的双氧水表面消毒5 min，最后无菌水洗5～6次[8-9]。同时将分离到的ACC脱氨酶活力高的菌株PG41、对照菌株枯草芽孢杆菌分别接种于TSB培养液中，于28℃下振荡培养24 h后，4℃离心收集菌体,菌体用无菌水洗涤离心2次后悬浮于无菌水中，在600 nm处将菌悬液光密度调整为0.5±0.02，即为接种菌悬液。

接种按以下两种方法进行。1）菌液培养接种：在培养皿底平铺一层灭菌的滤纸，分别用配好的7 mL分离菌菌悬液、枯草芽孢杆菌菌悬液、无菌水将滤纸浸湿，再将消毒处理洗净后的种子置于湿润的滤纸上。2）菌液浸种接种：将消毒后的种子分别浸于无菌水、枯草芽孢杆菌菌悬液和分离菌菌悬液中浸种过夜，然后再将处理的种子置于放有滤纸（用无菌水湿润）的培养皿中。接种后的培养皿上部用膜密封，置28℃恒温培养箱进行暗培养，待7d后分别测定各培养皿中种子发芽生长后的根和下胚轴长度。每皿放30粒种子,每个处理设3次重复。

1.2.4 ACC脱氨酶活性菌的初步鉴定

对分离的ACC脱氨酶活性最大的菌株PG41在LB平板上进行培养，观察菌株的形态、测定其大小，进行革兰氏染色，了解其培养特征；另外测定菌株分解利用糖类、氨基酸、无机盐以及抗酸抗碱抗盐能力和生长温度范围，了解ACC脱氨酶菌株的生理生化特征。

2 结果与分析

2.1 ACC脱氨酶活性菌的筛选及其酶活性检测

含有甘油的PAF培养基是选择性培养基，它有利于细菌的富集，而对真菌和放线菌的生长有抑制作用；DF是一种基本培养基，以(NH4)2SO4（2.0 g·L-1）为氮源；ADF也是基本培养基，它以ACC代替了 (NH4)2SO4作为唯一的氮源。通过从PAF到DF和ADF培养基的依次定向富集筛选。依据菌落的形态、大小和颜色等特征的区别，本研究从大豆根际土壤中共分离到69株能在以ACC为唯一氮源的ADF培养基上生长的细菌菌株，其中8株具有较高的酶活力，编号分别为PG41、PG25、PG37、PG4、PG51、PG69、PG74、PG83。从测定的酶活力（图 1）可以看出，这8株菌的ACC脱氨酶比活力有比较大的差异，其中PG41的ACC脱氨酶活性最高,为0.2871U·mg-1，PG74 酶活最小，为 0.132 4 U·mg-1，而作为对照的枯草芽孢杆菌ACC脱氨酶比活力只有 0.023 1 U·mg-1。

图1 分离的8株菌的ACC脱氨酶比活力

2.2 ACC脱氨酶活性菌酶对桔梗幼苗的促生作用

测定促生试验每个处理中桔梗幼苗的根和下胚轴长度，并对数据利用SPSS 17.0软件进行统计分析和Z检验，统计分析结果见表1和表2。表1表明，在用菌液培养法接种的条件下，同CK相比，大豆根际ACC脱氨酶活性菌株PG41、PG25、PG37、PG4、PG51、PG69、PG74、PG83均能促进桔梗种子幼苗根和下胚轴伸长，其中PG41的促生作用最强，PG25次之，其促进根相对伸长率分别为139.80%、136.64%，促进下胚轴相对伸长率分别为134.54%、129.29%，根和下胚轴的相对伸长都达到了极显著的水平（P＜0.01），菌株PG37、PG4、PG51、PG69、PG74、PG83 的促生作用也都达到显著水平（P＜0.05），而枯草芽孢杆菌接种时根和下胚轴的相对伸长率分别为94.50%和95.34%，表现出抑制作用。

表1 ACC脱氨酶活性菌液培养接种法对桔梗生长的影响

表2 ACC脱氨酶活性菌浸种接种法对桔梗生长的影响

表2表明，在用浸种法接种的条件下，同CK相比，大豆根际ACC脱氨酶活性菌株PG41、PG25、PG37、PG4、PG51、PG69、PG74、PG83 均能促进桔梗种子根和下胚轴伸长，其中PG41和PG25促进根相对伸长率分别为138.62%和135.944%,促进下胚轴相对伸长率分别为137.01%和132.84，根和下胚轴的相对伸长也都达到了极显著的水平（P ＜0.01），菌株PG37、PG4、PG51、PG69、PG74、PG83的促生作用也都达到显著水平（P＜0.05），而枯草芽孢杆菌则表现出了抑制作用。

对照促生作用测定和各促生菌株ACC脱氨酶活力测定的结果，可以明显看出，ACC脱氨酶活性高的菌株对桔梗的促生作用也比较显著，这也证明ACC脱氨酶活性菌株的促生作用和该酶可能相关。

从表1和表2中还可以发现，ACC脱氨酶活性菌株对桔梗的促生作用，在菌液培养接种法和浸种接种法两种处理方法中表现一致，并无显著差异，这表明不同的接种方式影响ACC脱氨酶活性菌株对植物的促生作用差异不大，因为不管那一种方式都能使菌株附着于种子表面，所以就能发挥促生作用。

2.3 ACC脱氨酶活性菌的形态特征与生理生化特征

2.3.1 菌株PG41形态特征观察

选促生作用最强的ACC脱氨酶活性菌株PG41在LB平板上培养，观察得菌落形态为圆形并隆起，边缘整齐，菌落表面光滑、湿润、透明，颜色为淡黄色；革兰氏染色结果为阴性细菌，菌体呈杆状（图 2）；测得菌体大小为（0.6～0.9）μm×（1.4～3.1）μm。豆科植物的根瘤菌一般是短杆状的革兰氏阴性细菌，由此推测侵入豆科植物根瘤中的根瘤菌很可能也是其根际土壤中具ACC脱氨酶活性的细菌。

图2 ACC脱氨酶活性菌株PG41的革兰氏染色

2.3.2 ACC脱氨酶活性菌株的生理生化特性

对ACC脱氨酶活性最高的菌株PG41进行生理生化特性测定（表3），结果显示，PG41菌株具有运动性，能够利用D-葡萄糖、D-乳糖、D-蔗糖、D-甘露醇、肌糖等各种糖类；能够产生苯丙氨酸脱氨酶、过氧化氢酶（接触酶）、氧化酶、纤维素和淀粉水解酶；在离子型表面活性剂吐温-20和吐温-80存在下能够稳定存活；能够在pH为4～13的条件下生长，生长的温度范围为10℃～45℃，耐NaCl的浓度为2%～10%。总之，大多数生化指标为阳性，表明ACC脱氨酶活性菌株PG41具有较强的适应能力，能够在酸、碱和盐以及干旱土壤中存在，这为其作为根际促生菌的应用提供了有利条件。

表3 ACC脱氨酶活性菌株PG41的生理生化特征

3 讨论与结论

本研究从大豆根际土壤中分离筛选到8株ACC脱氨酶活性较高的细菌，测得其中PG41和PG25菌株的ACC脱氨酶比活力分别为0.287 1 U·mg-1和 0.251 2 U·mg-1，其比活力明显大于黄盖等[18]从草莓根际土壤中分离得到的菌株 ACC30（ACC 脱氨酶比活力为 0.217 U·mg-1），而比魏素娜等[19]从旱地小麦根际土壤中分离得到的变形斑沙雷氏菌CS（ACC脱氨酶比活力为0.016 7 U·mg-1）和霍氏肠杆菌 AS（ACC 脱氨酶比活力为0.018 6 U·mg-1）的ACC脱氨酶比活力大出了一个数量级。促生作用试验发现，筛选的8株菌对桔梗的促生作用明显，PG41和PG25菌株对桔梗的促生作用达到极显著水平（P＜0.01）。通过测定酶比活力和促生作用最大的菌株PG41的生理生化特征表明，该菌株能利用的糖多、生存温度以及耐盐浓度和耐酸碱度范围都比较宽泛，具有较强的适应能力，这些可能都与其能够较好地在各种土壤环境生存和促生作用有关。

植物根际促生菌是寄生于植物根际能够促进植物生长的有益细菌、放线菌和真菌，它们通过分泌生长素、通过分解土壤中的难溶解物质为植物生长提供营养以及对植物病原菌发生拮抗作用等机制促进植物的生长[20-24]。自ACC脱氨酶活性菌发现以来，目前已经从小麦、玉米、油菜、紫花苜蓿、草木犀、水稻等许多植物根际相继分离出了许多具有ACC脱氨酶活性的促生菌[25-27]。同时发现从小麦、草莓、油菜等根际土壤中分离到的促生菌对豆科植物紫花苜蓿等的生长也有促生作用的研究报道[18-19]，近年来，还有不少从豆科植物根部分离到的促生菌对非豆科植物的生长有促生作用的研究报道[15-16]。可见促生作用的机制和本质在不同植物间可能有共同相通之处。对于具ACC脱氨酶活性的促生菌，目前大量的研究都认为它们是通过分解ACC、调节控制植物体内的乙烯水平而促进植物生长的[28-30]。本研究测定结果也表明，促生菌株对桔梗的促生作用和ACC脱氨酶比活力成正相关。本研究从大豆根际土壤中分离得到了ACC脱氨酶活性更高的细菌，拓宽了ACC脱氨酶活性菌的来源和人们对ACC脱氨酶活性菌株生物学特性的认识。

目前普遍认为，豆科植物根瘤菌有两种存在形式，一种是在根瘤内的共生存在形式，一种是在土壤中的游离存在形式，而且不仅土壤中的细菌可以侵入根瘤内形成根瘤菌，根瘤内的内生菌也可以进入到土壤中。赵龙飞等[30]从大豆根瘤内生菌中筛选出了具ACC脱氨酶活性的内生菌，对活性菌株的抗盐碱性、系统分类地位以及代表菌株的促生作用进行了研究，发现所分离的具ACC脱氨酶活性的内生菌对小麦的幼苗有明显的促生作用。本研究从大豆根际土壤中分离到具ACC脱氨酶活性的细菌，测得对桔梗具有明显的促生作用。关于大豆根瘤内和根际土壤中存在的ACC脱氨酶活性细菌是否为同一种属或同一株型菌株，值得进一步通过对菌株的16S rRNA基因序列同源性分析进行鉴定[31-32]。如果能找到同源性，将进一步证实根瘤菌和土壤根际细菌的关系，这对研究微生物的起源和系统进化具有重要意义。另外，还应进一步研究分离的活性菌株对桔梗的大田促生作用，开发桔梗的微生物促生菌剂。