王 堯，张小飞,2*，邹俊波,2，贾妍卓，王昌利,2*，史亚军,2，郭东艳,2

1陕西中医药大学药学院；2陕西中医药大学药学院，陕西省中药基础与新药研究重点实验室，咸阳 712046

高血压是一种常见的多发性疾病，其主要特征是全身动脉压升高，由多基因遗传、环境及其他危险因素相互作用而导致的全身性疾病[1]。理论和临床实践表明：可将高血压病纳入中医的“头痛”、“眩晕”、“肝风”等这类病证辨证论治。中医凭借整体论治，标本兼顾等优势，在对降低高血压病患者血压、保护靶器官、提高生活质量具有重要作用。

当归是临床中应用较为广泛的一味中药，味甘平、性温，有“十方九归”的说法。研究表明：当归中含有挥发油、多糖类、水溶性、油脂类及维生素类等多种化学成分。当归中的挥发油是对血管起解痉挛作用的主要活性成分，其中蒿本内脂是活性最强的成分[2,3]。然而当归挥发油具有降压作用的药效物质以及其作用途径尚不清楚。目前，利用网络药理学探索药物的作用机理研究成熟，并获得成功[3]。故采用网络药理学方法，探究当归挥发油主要降压的药效物质和靶点通路，为临床使用提供理论依据，本文研究流程见图1.

1 方法

1.1 当归挥发油化学成分的测定

本研究采用气相色谱-质谱联用(GC-MS)法测定当归挥发油的化学成分。气相色谱条件为：安捷伦HP-5ms(30 m×250 μm×0.25 μm)毛细管柱，高纯He，进样量1.5 μL，无分流，流速为1 mL/min，程序升温80 ℃(保持时间：0 min)，升温3 ℃/min至167 ℃(保持时间：2.5 min)，升温2 ℃/min至202 ℃(保持时间：0 min)，升温4 ℃/min至280 ℃(保持时间：15 min)。

质谱条件为：EI离子源、电子能量70 ev、离子源温度230 ℃、MS四极体温度150 ℃、溶剂延迟2.5 min、质谱扫描模式全扫描、扫描范围30～400 amu。

1.2 当归挥发油化合物的鉴定

数据处理由Data Analysis软件完成，将其阈值调整为14，对当归挥发性化学成分进行筛选。所分辨的质谱在NIST14标准谱库中检索，根据匹配度、保留指数和文献已报道物质进行核对。保留指数的测定采用相同的气相色谱条件测定正构烷烃(C8～C40)的保留时间，自动质谱退卷积定性系统(AM-DIS)根据正构烷的保留时间，自动计算出当归中各挥发性化合物的保留指数。

式中：tR(x)、tR(n)、tR(n+1)分别表示待测化合物，含碳数n和碳数n+1的正构烷烃的保留时间且tR(n)

1.3 当归挥发油主要活性成分作用靶点以及高血压疾病相关靶点的获取

利用SwissTargetPrediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)获取当归挥发油相关成分靶点共计1 081个，剔除重复项625个。通过Mendelian人类基因和基因表型综合数据库OMIM(https://www.omim.org/)获得高血压相关靶点236个。DisGENET数据库(https://www.disgenet.org/)获得高血压相关靶点723个；剔除重复项，共计高血压相关靶点792个。并将高血压相关靶点和当归挥发油潜在作用靶点交互筛选出共同靶点。

1.4 当归挥发油活性成分—高血压疾病靶点网络的构建

通过Cytoscape v3.7.1建立当归挥发油活性成分—高血压靶点网络图。利用该软件中的“Network analyzer”功能，分析其网络拓扑属性，主要考察其节点度值分布(node degree distribution)和介数中心性(betweenness centrality)2个重要的网络拓扑参数。度值反映节点与其他节点之间的连接数；介数中心性是经过该节点的路径数与网络中最短路径总数的比值；度值和介数是量化节点在网络中重要性的拓扑参数[4]。最后，利用网络拓扑属性对当归挥发油治疗高血压的主要成分进行分析。

1.5 靶蛋白交互作用网络(PPI)的构建

为研究当归挥发油与降压靶点之间的相互作用，在STRING(https://string-db.org/cgi/input.pl)平台构建其靶蛋PPI网络。物种设为“Homo sapiens”，最低相互作用的阀值设为中等置信度0.4“Medium confidence”，其余参数保持默认设置，得到蛋白相互作用，下载其tsv文件。通过Cytoscape v3.7.1进行拓扑属性分析筛选出PPI网络中的关键靶蛋白。

1.6 信号通路与生物过程分析

运用Rstudio软件R语言编程中的clusterProfiler程序包对当归挥发油治疗高血压的靶基因进行KEGG信号通路富集分析和Gene Ontology(GO)生物过程富集，分析当归挥发油治疗高血压作用靶点的主要信号通路和生物过程，并利用R语言编程进行绘图分析。

1.7 分子对接

分子对接(Molecular docking)是一种基于预测配体与其相结合受体位点的计算方法，是药物设计的重要技术[5,6,7]。基于活性成分筛选出两方中核心活性成分与靶标，采用Discovery Studio 4.5 Client软件中的LibDock模块进行分子对接，并得出对接得分(Score)值，得分值越大，配体与受体结合越稳定。蛋白下载于PDB数据库(https://www.rcsb.org/)，蛋白经加氢、准备、赋予力场后,定义活性位点。候选化合物下载于PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)，保存为SDF格式。分子对接为揭示核心成分作用机制、药理复杂网络分析及当归挥发油功效机制奠定了基础。

2 结果

2.1 当归主要活性成分

通过GC—MS测定出当归挥发油化合物共20个(见表1)，图2所示为当归挥发油离子质谱图。

表1 当归挥发油主要活性成分

续表1(Continued Tab.1)

图2 当归挥发油成分离子图

2.2 成分-靶点网络图的构建

将625个药物靶点和792个高血压相关靶点交互共得到115个共同靶基因(见图3)。将115个靶基因作为当归挥发油治疗高血压靶点，建立当归挥发油活性成分—靶点网络图。如图4所示，共有134个节点，398条边；绿色节点为当归挥发油化学成分，粉色节点为当归挥发油对应的高血压节点，398条边代表了化学成分与靶点的相互作用。

图3 当归挥发油作用靶点与高血压疾病靶点交集的韦恩图

图4 当归挥发油成分-靶点网络图

2.3 靶点PPI网络分析

当归挥发油治疗高血压疾病靶蛋白PPI网络有114个节点(其中有1个靶蛋白与其他蛋白未发生相互作用)，1 080条相互作用连线(见图5)。对排序均在前15的度值和介数的靶蛋白进行交集，共筛选出10个度值和介数的靶蛋白，提示这些靶蛋白在PPI网络中起关键作用，可能是当归挥发油治疗高血压的关键靶点(见表2)。

图5 当归挥发油治疗高血压的靶点PPI网络图

表2 关键靶点拓扑参数

2.4 KEGG信号通路分析

将当归挥发油115个高血压疾病靶点在KEGG信号通路富集，根据P<0.05筛选到122条通路。如图6所示列出了KEGG信号通路的前15条；其中有21个靶点参与了神经活性配体-受体相互作用通路，有20个靶点参与了cGMP-PKG信号通路，20个靶点参与了钙信号通路，15个靶点参与了糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路，15个靶点参与了HIF-1信号通路。

图6 KEGG信号通路图

2.5 GO生物过程分析

将当归挥发油115个高血压疾病靶点在GO生物过程富集，根据P<0.05筛选得：BP生物过程富集到1 779个结果，CC细胞组成富集到54个结果，MF分子功能富集到165个结果。GO分析显示115个高血压疾病靶点在生物过程中显著富集(BP，图7A～C)，包括有32个靶点参与的血管循环系统(vascular process in circulatory system)，有28个靶点参与的管径的调节(regulation of tube diameter)，有28个靶点参与的血管管径的调节(regulation of blood vessel diameter)，有28个靶点参与调节血压(regulation of blood pressure)，有24个靶点参与的血管内径负调控(negative regulation of blood vessel diameter)等过程。细胞成分(CC，图8ABC)分析表明，凹陷(caveola)，质膜筏(plasma membrane raft)，膜筏(membrane raft)，膜微域(membrane microdomain)，膜区(membrane region)等部分都是分类的。就分子功能而言(MF，图9ABC)，有12个靶点参与了血红素结合(heme binding)以及四吡咯结合(tetrapyrrole binding)，有11个靶点参与了氧化还原酶活性通过与分子氧的结合或还原，作用于成对的供体上(oxidoreductase activity,acting on paired donors,with incorporation or reduction of molecular oxygen)，有7个靶点参与了核受体活性(nuclear receptor activity)和转录因子活性，直接配体调节的序列特异性DNA结合(transcription factor activity,direct ligand regulated sequence-specific DNA binding)等过程。

图7 生物过程富集图

图8 细胞组成富集图

图9 分子功能富集图

2.6 分子对接结果分析

运用Discovery Studio 4.5 Client将筛选出来的关键靶点与对应核心成分进行对接。运用LibDock模式进行对接，对接结果如表3所示，其中度值最大的ATK1与成分1,4-Benzenediol,2,3,5-trimethyl-对接稳定，得分值为77.054 3，接近于阳性药对接得分值。图10A为靶点AKT1与成分1,4-Benzenediol,2,3,5-trimethyl-对接结果图；B为靶点VEGFA与成分1,4-Benzenediol,2,3,5-trimethyl-对接结果图；C为靶点MAPK3与成分(1R,4R,4aS,8aR)-4,7-dimethyl-1-(prop-1-en-2-yl)-1,2,3,4,4a,5,6,8a-octahydronaphthalene对接结果图；D为靶点ALB与成分1,4-Benzenediol,2,3,5-trimethyl-对接结果图；E为靶点SRC与成分(E)-3-butylidene-4,5-dihydroisobenzofuran-1(3H)-one对接结果图。

图10 核心成分与关键靶点对接结果图

表3 分子对接结果

3 讨论

高血压是导致心脑血管疾病的一个重要因素之一，常引起心、脑、肾三脏的并发症。诱发血压升高的机制相对比较复杂，有研究表明当归挥发油对高血压疾病的防治发挥一定的作用。主要通过抑制血管炎症反应[8]、调节胰岛素信号通路及血管内皮生长因子(VEGF)信号通路相关miRNA的表达[9]；明显降低SHRs的收缩压，改善心肌组织形态等途径对高血压病起治疗作用[10]，而且当归挥发油对血管内皮还具有一定的保护作用[11]。

本文利用分子对接技术将筛选出来的当归挥发油核心活性成分与关键靶点进行对接，对接结果显示对接稳定。其中(E)-3- butylidene-4,5-dihydroisobenzofuran-1(3H)-one(藁本内酯)含量最高，可通过降低氧化应激性损伤以及抗细胞凋亡、清除体内氧自由基、缓解脑细胞的损伤而发挥降压作用[11]。此外本研究显示tetrasiloxane,decamethyl-(十甲基四硅氧烷)、1,4-benzenediol,2,3,5-trimethyl-(三甲基氢醌)、butanoic acid,4-methoxy-,methyl ester(甲氧基丁酸甲酯)等成分也发挥降压的作用，提示这些成分可能为当归挥发油治疗高血压的新成分。

PPI网络分析发现AKT1、VEGFA、MAPK3、ALB、SRC等是当归挥发油降压的关键靶点。AKT1是一种丝氨酸(苏氨酸)激酶，在细胞代谢、存活、周期调节和转录调控中发挥重要作用。Miao等[12]在对高血压心肌纤维化疾病的研究中：表明AKT1的表达和活化可以促进AngeⅡ诱导的心肌纤维化，提示AKT1在高血压心肌纤维化中发挥作用。血管内皮生长因子A(VEGFA)是一种强效且具有特异性的内皮细胞有丝分裂剂，与其受体结合可以促进内皮细胞的分裂和增殖，增加微血管的通透性。Wang等[13]体内实验表明：血管VEGF可以刺激血管的发生和生长，发现当归挥发油能降低血清中VEGF的水平，说明其降压作用于血清中的VEGF水平有关。尿ALB与高血压性肾损害的进展密切相关，Li[14]研究表明：尿Alb水平有助于评估高血压患者早期肾损伤；也有研究表明尿液UmAlb/Ucr 的变化比血清中Scr及BUN的变化发生更早，因此能准确、敏感地反映早期高血压肾损害的情况[15]。SRC酪氨酸蛋白激酶是一个非受体型原癌基因酪氨酸激酶，Zeng等[16]论述：SRC通过不同信号途径对血压产生影响，对血压具有双向调节作用。

本研究为了分析当归挥发油降压的治疗靶点所涉及的信号通路和生物过程，对靶基因进行了GO功能富集和KEGG信号通路分析，GO功能富集发现当归挥发油治疗高血压的生物过程包括循环系统中的血管过程、管径调节、血管大小的调节、血管直径的调节、血压调节、血管直径负调节、血管收缩、血液循环调节、对氧含量的反应、第二信使介导的信号转导，可以发现这些生物过程在降压过程中发挥重要作用。KEGG通路富集到神经活性配体-受体相互作用通路、cGMP-PKG信号通路，钙信号通路，糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路，HIF-1信号通路等多条通路。神经活性配体-受体相互作用通路是与细胞内和细胞外信号通路有关的所有受体和配体在质膜上的集合，调节生理节律、内分泌、情绪、学习、记忆等，内分泌紊乱是高血压的常见病因；此外不良的情绪也会直接或间接的影响高血压[17]。根据报道[18]：大多数组织中cGMP-PKG信号通路可调节血管平滑肌细胞收缩和舒张，抗高血压。抗心肌肥大，抗动脉粥样硬化，抗血管损伤/再狭窄。此外，钙离子信号通路控制新陈代谢、分泌、平滑肌收缩、增殖等多种过程调节血压[19]，提示当归挥发油可能通过调节平滑肌收缩来发挥药效。高血压合并糖尿病患者肾损害有很大可能性发生，研究表明：AGE通过RAGE可引起肾脏中NF-κB通路的激活，抑制NF-κB可以降低血压并且部分减轻心肌肥厚[20]。提示当归挥发油可能通过调节AGE-RAGE信号通路对高血压伴糖尿病并发症发挥治疗作用。有研究显示[21]：HIF-1介导的信号通路可能通过调节肾脏髓质功能和水盐电解质平衡参与血压调节。

综上所述，本文运用网络药理学方法，对当归挥发油的成分和作用靶点进行了系统性研究。利用Rstudio软件R语言编程，从生物过程(biological process)、细胞组成(cellular component)与分子功能(molecular function)三个水平对其进行富集分析，同时也进行了KEGG富集分析。最后利用分子对接等手段，揭示其通过多组分、多靶点、多通路，从而发挥整体协同降压的药理机制。