蔡菲菲，王秀峰，周钱梅，陆奕宇，苏式兵

上海中医药大学交叉科学研究院中医复杂系统研究中心，上海 201203

乳腺癌(breast cancer)在中医学范畴被称为“乳岩”、“乳石痈”等，是女性中最常见的恶性肿瘤之一，近年来发病率不断上升，发病年龄越来越小，严重威胁着女性的健康[1]。虽然乳腺癌在早期筛查、手术和放化疗技术等方面有了显著的进展，但对于晚期乳腺癌的全身性转移，临床缺少安全有效的治疗药物，是目前临床治疗的难点，也是乳腺癌患者死亡的主要原因之一。中药及其活性成分被报道具有抑制乳腺癌转移的作用[2]，成为乳腺癌转移治疗药物的研究热点之一。黄芩素(baicalein)是中药黄芩的主要生物活性成分之一，在体内外研究中均已被证明具有抗肿瘤、抗炎、抗心血管疾病和抗菌活性[3]。近年来，黄芩素因能抑制肿瘤细胞的增殖，或诱导低毒性癌细胞的凋亡和自噬性细胞死亡[4]，尤其因其能抑制乳腺癌的转移而受到越来越多的关注[5,6]。乳腺癌组织中异常激活的RhoA和ROCK，引起下游MLC磷酸化增强，导致细胞的迁移和侵袭[7]。本研究旨在通过建立人乳腺癌异种移植瘤裸鼠模型，观察黄芩素抑制乳腺癌生长和转移的体内作用，并探讨黄芩素参与ROCK介导的细胞骨架重组抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移的作用机制。

1 材料

1.1 动物

4～6周龄的BALB/c裸小鼠，雌性，体质量20±2 g，动物合格证编号：SCXK(沪)2012-0002，于上海中医药大学动物实验中心SPF实验室饲养。

1.2 药物

黄芩素(含量98%)产品编号：05-2001，上海中药标准化研究中心提供，用二甲基亚砜(DMSO)稀释为100 mmol/L，0.22 μm微孔滤膜过滤后分装。紫杉醇注射液，批号090603，30 mg/5 mL，购自海口市制药厂有限公司。

1.3 试剂

RPMI 1640培养基(美国GIBCO公司)；胎牛血清FBS(美国PAA公司)；胰蛋白酶(美国Amersco公司)；DMSO(美国Sigma公司)；SDS、Aprotinin、Tris-base(国药集团化学试剂有限公司)；PMSF、APS、TEMED、蛋白定量试剂盒(上海威奥生物科技有限公司)；抗体GAPDH等(美国Cell Signaling Technology公司)；Transwell小室(美国Corning-Costar公司)；Y-27632(美国MedChemExpress公司)。

1.4 仪器

生物安全柜(HFsafe-500，香港力康发展有限公司)；CO2细胞恒温培养箱(3111，美国Thermo Forma公司)；倒置显微镜(100-120，日本Olympus公司)；酶联免疫检测仪(Synergy2，美国BioTek公司)；离心机(ST16R，美国Thermo Forma公司)；Bio-Rad电泳仪及转印系统(1658033，美国Bio-Rad公司)；化学发光成像仪(Tanon 2500，上海天能科技有限公司)。

2 方法

2.1 黄芩素安全性评价

将30只4～6周龄的SPF级BALB/c雌性裸小鼠随机分为正常对照组、生理盐水组、黄芩素组，每组10只。生理盐水组、黄芩素组分别予0.2 mL生理盐水和黄芩素组100 mg/kg腹腔注射给药，每天一次，共给药8周。每日称量并记录体重，8周后，摘眼球取血，颈脱位法处死，将血液离心分离血清和血细胞冻存于-80 ℃。检测血清肝功指标ALT、AST和肾功能指标BUN、Cr以评价黄芩素的毒副作用。本研究根据上海中医药大学动物护理和使用委员会出版的《实验动物护理和使用指南》中规定的动物护理标准进行，方案经上海中医药大学动物保护与利用委员会批准。

2.2 黄芩素对人乳腺癌异种移植瘤裸鼠的作用研究

20只SPF级BALB/c雌性裸小鼠，随机分为正常组、模型组、紫杉醇组及黄芩素组，每组5只。除正常组外，将细胞总数为5×106的人乳腺癌细胞MDA-MB-231注射到裸鼠右上肢腋下乳房脂肪垫中，观察并记录裸鼠体重变化和肿瘤生长情况。在造模后的第二天开始给药。黄芩素组以50 mg/kg[5]，隔天一次给药0.2 mL；紫杉醇组以10 mg/kg[8]，每三天一次给药0.2 mL；正常组、模型组以等量的生理盐水0.2 mL腹腔注射给药，每天一次，共给药8周。给药8周的裸鼠称体重后，摘眼球取血，颈脱位法处死。血液离心分离血清和血细胞冻存于-80 ℃。完整剥离肿瘤组织，称取肿瘤组织重量，一部分放入福尔马林组织固定液中，另一部分-80℃冻存。用1 mL注射器从裸鼠主支气管注入适量福尔马林固定液后摘下整个肺脏，放入福尔马林中固定，常规石蜡包埋，4 μm切片做H&E染色。

2.3 黄芩素抑制乳腺癌侵袭转移作用机制研究

2.3.1 细胞分组及处理

用含10% FBS的1640培养基常规培养MDA-MB-231细胞至对数生长期，分为正常对照组，黄芩素组，抑制剂Y-27632组和黄芩素组与抑制剂联用组。黄芩素组分别用100、50、25 μM的黄芩素进行干预，抑制剂组用10 μM Y-27632干预，联用组以100 μM黄芩素+10 μM Y-27632干预细胞。

2.3.2 Transwell小室实验评估细胞迁移力

将各组MDA-MB-231细胞预先接种在24孔Transwell小室上室中，下室加入含10% FBS的1640培养基，37 ℃，5% CO2培养24 h后，清洗并擦拭除去上室表面的非迁移细胞。将迁移的细胞用4%多聚甲醛固定，用0.1%结晶紫染色，并在显微镜下对每个腔室的至少三个视野进行计数。迁移抑制率=(1-实验组迁移细胞数/对照组迁移细胞数)×100%。

2.3.3 免疫荧光染色观察细胞骨架蛋白F-actin变化

各组MDA-MB-231细胞经用药处理24 h后，用4%多聚甲醛固定，室温下在湿盒中孵育稀释好的一抗及二抗，用PBS清洗，干燥后封片，即刻在激光共聚焦显微镜检查下观察。

2.3.4 Western blot法检测细胞蛋白表达

收集各组MDA-MB-231细胞并裂解，以BCA蛋白测定其蛋白浓度。用SDS-PAGE凝胶电泳分离等量蛋白质，并转移到PVDF膜上。在4 ℃下将膜与主要抗体一起孵育过夜，将GAPDH作为内参对照，在室温下用二抗孵育1 h。最后，使用化学发光成像仪可视化目标蛋白条带

2.4 统计学方法

使用SPSS 25.0和Graphpad Prism 6.0软件进行统计分析和作图。所有数据均表示为均数±标准差，并使用One-way ANOVA进行统计分析，P<0.05被认为具有统计学意义。

3 结果

3.1 黄芩素(100 mg/kg)对裸鼠未产生明显毒副作用

为了阐明黄芩素的安全性，我们检测了100 mg/kg黄芩素在裸鼠体内是否产生毒副作用。每周检测各组裸鼠的体重变化，正常对照组和用药组之间裸鼠体重没有显著的差异(见图1)。此外，图1中的血生化结果显示，裸鼠肝功指标ALT、AST和肾功能指标BUN、Cr均没有统计学差异。

图1 黄芩素对裸鼠体重及肝肾功能的影响

3.2 黄芩素抑制乳腺癌异种移植瘤裸鼠肿瘤生长和肺转移

为了观察黄芩素对乳腺癌生长和转移的体内作用，采用人乳腺癌MDA-MB-231细胞株建立移植瘤裸鼠肺转移模型。如图2结果所示，用药组裸鼠肿瘤的瘤体体积和重量明显小于模型组，且差异统计学意义(P<0.01)，其中黄芩素组抑瘤效果弱于紫杉醇组。图3中裸鼠肺转移组织病理结果显示，与正常组比较，其余各组均有癌细胞肺转移结节，而用药后转移结节数和转移灶明显小于模型组，紫杉醇组肺转移率为60%，黄芩素组肺转移率为80%。该结果表明黄芩素具有明显抑制乳腺癌原位肿瘤生长和肺转移的作用。

图3 黄芩素对移植瘤裸鼠体内肿瘤肺转移的抑制作用(HE，×100)

图2 黄芩素对移植瘤裸鼠体内肿瘤生长的抑制作用

3.3 黄芩素和ROCK抑制剂Y-27632抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移

黄芩素在体内实验中表现出抑制乳腺癌生长和转移的作用，我们进一步在体外研究黄芩素抑制乳腺癌细胞转移的作用和机制。通过体外迁移实验，我们分别用100 μM黄芩素、10 μM Y-27632(Rho下游激酶ROCK的特异性抑制剂)、100 μM黄芩素+10 μM Y-27632处理MDA-MB-231细胞24 h，发现对照组相比，黄芩素和Y-27632(10 μM)均能够显著抑制MDA-MB-231细胞的迁移力(P<0.001)。与单独使用抑制剂相比，将Y-27632与黄芩素联合应用后抑制细胞迁移的作用更明显(P<0.01)(见图4)。

图4 黄芩素和Y-27632对MDA-MB-231细胞迁移力的影响

3.4 黄芩素和ROCK抑制剂Y-27632抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞骨架蛋白表达

通过体外细胞迁移实验证实黄芩素能够抑制细胞迁移，我们进一步利用细胞荧光化学染色方法，观察用药后MDA-MB-231细胞骨架蛋白F-actin的变化。实验发现未用药处理的细胞内有明显的蛋白质纤维束形成，而经黄芩素和Y-27632处理24 h后的细胞骨架蛋白表达被抑制，两种药物联合应用效果更明显(见图5)。

图5 黄芩素和Y-27632对MDA-MB-231细胞迁移力的影响

3.5 黄芩素对乳腺癌MDA-MB-231细胞蛋白表达的影响

通过以上的实验我们知道黄芩素具有抑制人乳腺癌MDA-MB-231体外迁移的作用，并且该作用与影响细胞骨架蛋白的重组有关。为进一步明确黄芩素在这一过程中影响了哪些蛋白参与调控骨架蛋白重组，我们进行了Western blot实验。结果如图6所示，100 μM黄芩素能够显著抑制ROCK1(P<0.05)，Rac1(P<0.01)和RhoA(P<0.05)的表达。Rho和ROCK的下游调控蛋白是肌球蛋白轻链蛋白MLC。我们发现100 μM黄芩素和10 μM 的Y-27632均能够明显抑制MLC的磷酸化(P<0.05)，两药合用效果显著(P<0.01)。这说明黄芩素抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移可能与抑制RhoA-ROCK-MLC信号通路相关。

图6 黄芩素和Y-27632对MDA-MB-231细胞蛋白表达的影响

4 讨论

黄芩素作为黄芩根的有效提取物，在多种癌症中均显示出了其抗癌能力[9,10]。有研究表明，黄芩素能够抑制PI3K/AKT信号传导诱导乳腺癌细胞凋亡和自噬[11]，通过抑制MMP-2和MMP-9的表达影响乳腺癌细胞的侵袭和迁移能力[12]。然而，黄芩素抗肿瘤的作用尚未在临床试验中得到证实，其抑制乳腺癌细胞迁移的具体机制也尚未解明。本研究在人乳腺癌异种移植瘤裸鼠模型上，观察到黄芩素能够抑制乳腺癌原位肿瘤生长和肺转移，抑制效果不及紫杉醇，但是对裸鼠的体重和肝肾功能均没有显著影响，表明黄芩素应用于乳腺癌防治可能是比较安全的，这与既往黄芩素抑制乳腺癌裸鼠肺转移模型的体内研究结果一致[13]。

肿瘤细胞的迁移运动能力是肿瘤发生转移的主要原因之一，而细胞的迁移运动受到Rho家族基因的调控。它们通过调控细胞的骨架重组，细胞的黏附和细胞的运动等参与癌转移[14]。单个或集体肿瘤细胞迁移是这一复杂过程中的关键步骤，涉及细胞外基质(ECM)重塑以及与相邻细胞和与基础结缔组织细胞粘连的动态重组，信号蛋白以及细胞骨架相关的支架成分，以协调的方式介导细胞与ECM的粘附[15]。在本研究中观察到黄芩素具有抑制MDA-MB-231细胞迁移的作用，与本研究实验结果相似的是，有研究报道，黄芩素可能通过抑制MMP-9蛋白表达，抑制MDA-MB-231细胞增殖和迁移[16]。

Rho家族蛋白对细胞的迁移运动起调控作用，RhoA是Ras超家族中小分子量的G蛋白成员之一，主要是通过影响细胞骨架参与调控肿瘤细胞的侵袭和转移[17]。Rac1是Rho家族Rac亚家族的成员，能够调控细胞生长和细胞骨架重组[18]，是许多细胞过程的多效性调节剂，包括细胞周期，细胞间粘附，以及通过肌动蛋白网络调节细胞运动性[19]。Rho相关蛋白激酶(ROCK)是一种属于AGC(PKA/PKG/PKC)丝氨酸-苏氨酸激酶家族的激酶[20]，是RhoA的下游靶效应分子，它主要通过作用于细胞骨架而参与调节细胞的形状和运动[21]。已发现大鼠ROCK是Rho的第一个效应物，它们通过使下游肌球蛋白轻链MLC的磷酸化来诱导应激纤维的形成和粘着斑[22]，目前已经鉴定出两个小鼠ROCK同工型ROCK1和ROCK2。我们实验发现黄芩素同ROCK的特异性抑制剂Y-27632单用或联合应用能够改变细胞的骨架重组，抑制细胞迁移，同时抑制ROCK1、Rac1和RhoA的蛋白表达水平，并且抑制MLC的磷酸化。这表明黄芩素抑制癌细胞迁移可能与Rho-ROCK-MLC通路相关。

综上，黄芩素能够抑制人乳腺癌细胞MDA-MB-231异种移植瘤裸鼠的肿瘤生长和肺转移，且无明显肝肾毒性。而且，黄芩素可能是通过调节Rho-ROCK-MLC通路，影响细胞骨架蛋白表达，从而抑制乳腺癌细胞迁移。