李家妮，韩佳佳，程瑞华，赵唐莲，张可锋，饶聪矛，吴 卫，高 雅

桂林医学院药学院，桂林 5410041

免疫性肝损伤是由免疫应答介导的，常伴随炎性细胞浸润、肝细胞索结构破坏[1]。并且，该损伤是肝纤维化、肝硬化乃至肝脏肿瘤等终末病变发生发展的必经之路，决定了疾病的转归与恶化[2]。最近，免疫性肝损伤在我国的发病率呈现逐年递增趋势，临床上大多采用免疫抑制剂，但治疗效果并不明显，停药后易复发[3]。因此，寻求防治免疫性肝损伤的行之有效的药物迫在眉睫。老鹳草为牻牛儿苗科老鹤草属，主产于我国东北、华北等几个地区以及某些亚洲国家[4]。老鹳草素(geraniin)主要从老鹳草中分离得到，具有抗氧化、抗炎等多种作用[4,5]。有研究表明，老鹳草素减少了由H2O2诱导的促凋亡蛋白Bax的表达，促进抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，但并未对相关凋亡通路进行深入研究[6]。此外，Wu等[7]研究表明，老鹳草素和可乐宁联合使用能显著减弱脂多糖(LPS)刺激的RAW 264.7巨噬细胞和对乙酰氨基酚(APAP)诱导的小鼠免疫性肝损伤。目前，我们尚未发现有相关文献对老鹳草素基于JNK通路对免疫性肝损伤的作用进行报道。因此，本实验在Wu等[7]和本课题组已证实老鹳草素对D-氨基半乳糖[4]和四氯化碳[5]诱导的肝损伤具有保护作用的基础上，基于JNK通路进一步研究老鹳草素对LPS导致的免疫性肝损伤小鼠的作用，并探讨其作用机制。

1 材料与试剂

1.1 实验动物

SPF级昆明种小鼠，雄性，共60只，体重18～22 g，4周龄，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，在饲养条件(室内温度：18～22 ℃，相对湿度：50%～60%)下适应性饲养1周。许可证号：SCXK(湘)2019-0004。

1.2 实验药物与试剂

老鹳草素(上海源叶生物科技有限公司，HPLC≥98%，批号：P11A8F33736)；脂多糖(索莱宝生物科技有限公司)；水飞蓟素(美仑生物技术有限公司，批号：M1120A)；门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆红素(TBIL)试剂盒(南京建成生物工程公司)；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)和白介素-6(IL-6)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(伊莱瑞特生物科技有限公司)；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(南通市碧云天生物技术研究所)；PVDF膜(Bio-Rad公司，美国)；兔抗鼠phospho-ASK1多克隆抗体、兔抗鼠ASK1多克隆抗体(武汉三鹰)、兔抗鼠phospho-MKK4多克隆抗体、兔抗鼠MKK4多克隆抗体、兔抗鼠phospho-JNK多克隆抗体、兔抗鼠JNK多克隆抗体、兔抗phospho-c-Jun多克隆抗体、兔抗鼠c-Jun多克隆抗体(北京奥博森生物技术有限公司)；β-actin(天锡傲锐东源生物科技有限公司)；辣根酶标记的二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)；苏木素和伊红染液(北京中杉金桥生物技术有限公司)；Super ECL Plus超敏发光液(北京普利莱基因科技有限公司)。

1.3 仪器

全自动样品快速研磨仪(上海净信事业发展有限公司)；TGL-16K台式高速冷冻离心机(湖南湘仪离心机厂)；切片机(上海涵飞医疗器械有限公司)；O1ympus BX51显微镜(日本奥林巴斯)；Transferpette®移液器(德国普兰德公司)；Epoch酶标仪(美国Bio-tek公司)；纯水器(博美生物科技有限公司)；冷冻恒温振荡器(常州申光仪器有限公司)；垂直电泳仪、转膜仪(美国Bio-Rad公司)；石蜡包埋机(浙江省金华市科迪仪器有限公司)；Tanon5 200全自动化学发光图像分析检测系统(北京原平皓生物技术有限公司)。

2 方法

2.1 造模及给药

实验前给予60只SPF级昆明种小鼠自由饮食和活动，7天之后随机分为正常组、模型组、水飞蓟素组(180 mg/kg)和老鹳草素低、中、高剂量组(50、100、200 mg/kg)，每组10只。灌胃给药每天1次，正常组及模型组小鼠灌胃生理盐水连续10天。10天后，参照文献[8]，模型组和老鹳草素各剂量组小鼠腹腔注射LPS(10 mg/kg)，正常组注射等体积的0.9% NaCl溶液。造模后8 h正常饮食，之后的16 h禁食不禁水，造模时间共24 h，之后所有小鼠眼球取血并收集肝组织。血液于离心机中分离血清，取部分肝左叶组织，用4%多聚甲醛溶液固定，剩余肝组织保存于液氮罐中或者-80 ℃冰箱，可保存半年，为后续实验做准备。

2.2 实验小鼠情况观察

每天观察记录小鼠的外观形态、活动和进食状态、体重改变情况、生存情况和肝组织的外观形态。

2.3 肝组织病理学检测

取4%多聚甲醛溶液固定的肝组织，严格按照HE染色说明书，进行常规石蜡包埋，切片后于二甲苯中脱蜡，酒精中脱水，苏木精和伊红染料中依次染色，树脂封片后于光学显微镜下观察肝组织形态学的改变情况。

2.4 肝损伤指标测定

取离心后的血清，生化法测定肝功能因子ALT、AST、ALP、TBIL和氧化应激指标MDA、GSH-Px、SOD水平；ELISA法检测组织中炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的含量。两个测定方法均按照试剂盒的操作步骤加入各反应试剂，根据标准曲线及公式计算绝对OD值，分析计算以上因子的活性或含量。

2.5 蛋白表达情况的测定

用RIPA裂解液从肝组织样品中提取总蛋白，用BCA试剂盒定量。用10%SDS-PAGE电泳分离含30 μg总蛋白的样品，于220 mA冰水浴条件下以恒流转膜1.5 h转移到PVDF膜上。用含8%脱脂奶粉的TBST缓冲盐水封闭β-actin(1∶2 500)、ASK1、p-ASK1、MKK4、p-MKK4、JNK、p-JNK、c-Jun、p-c-Jun(1∶1 000)蛋白条带，4 ℃封闭过夜。用TBST洗涤3次(10 min/次)，放入一抗轻摇，4 ℃下孵育过夜。同上TBST洗涤三次后，在4 ℃冰箱于含5%脱脂奶粉TBST稀释的二抗中孵育1.5 h。同上TBST洗涤三次后，ECL显色剂按A∶B =1∶1的比例现配现用，注意避光，用Tanon5 200全自动化学发光图像分析系统显影，以β-actin为内参，分析蛋白灰度并计算蛋白相对表达量。

2.6 数据统计学分析

3 实验结果

3.1 老鹳草素对免疫性肝损伤小鼠状况的影响

正常组小鼠生长状态良好，活动敏捷，皮毛有光泽，进食饮水正常。模型组小鼠造模后昏昏欲睡，全身皮毛蓬松，反应迟纯，活动减少。水飞蓟素组小鼠精神状态较好，皮毛光泽度稍有减弱，饮食及活动力较正常组有减弱，但无明显差异。老鹳草素低剂量组小鼠精神萎靡，进食减少，倦卧少动，对外界刺激反应迟钝，毛光泽度欠佳。老鹳草素中、高剂量组小鼠精神状态较好，皮毛光泽度和水飞蓟素组相当。

3.2 老鹳草素对免疫性肝损伤小鼠肝组织形态的影响

肉眼观察，正常组小鼠肝脏外观正常，被膜光滑完整，颜色鲜红有光泽，边缘锐利，质地柔软。模型组小鼠肝脏肿大，颜色轻微发黄、泛白，表面呈现颗粒斑点状。与模型组比较，老鹳草素中、高剂量组和水飞蓟素组肝脏表面光滑，有光泽，肝损伤均有所减轻，而老鹳草素低剂量组减轻不明显。

HE染色显示，显微镜下可见正常组(图1A)小鼠整个肝小叶结构清晰完整，肝脏细胞基本无病变、坏死和凋亡，肝脏内无炎症细胞浸润。模型组(图1B)肝小叶结构大部分不完整，破损严重，肝小叶坏死和裂解，并可见大量枯否细胞增生和炎症淋巴细胞的浸润。水飞蓟素组(图1C)肝组织结构轻度改变，肝细胞点状坏死，炎性细胞浸润为轻度。老鹳草素低剂量组(图1D)肝组织结构改善不明显，而老鹳草素中剂量组(图1E)和老鹳草素高剂量组(图1F)肝组织结构基本存在，肝细胞轻度固缩、坏死。结果提示，老鹳草素可改善LPS诱导的小鼠免疫性肝损伤的病理变化，具体结果见图1。

图1 肝组织HE染色病理检查图(200×)

3.3 老鹳草素对免疫性肝损伤小鼠血清肝功能因子ALT、AST、ALP和TBIL的影响

与正常组比较，模型组小鼠血清肝功能因子ALT、AST、ALP和TBIL水平显著升高，差异均具显著性(P<0.01)。与模型组比较，老鹳草素中、高剂量组小鼠血清肝功能因子ALT、AST、ALP和TBIL水平均呈现显著下降趋势，差异均具有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。具体结果见表1。

表1 老鹳草素对血清中肝功能因子ALT、AST、ALP和TBIL的影响

3.4 老鹳草素对免疫性肝损伤小鼠血清中氧化应激因子MDA、GSH-Px、SOD水平的影响

采用MDA、GSH-Px与SOD测定试剂盒检测LPS诱导的免疫性肝损伤血清氧化应激水平的影响，结果显示LPS造模后，能够使LPS诱发的SPF级昆明种小鼠血清SOD、GSH-Px活力降低，而MDA水平升高(P<0.01)，说明LPS能够加重小鼠氧化应激水平。与模型组相比，老鹳草素中、高剂量组可提高血清中SOD、GSH-Px活力，降低MDA水平(P<0.01或P<0.05)，这些数据证实老鹳草素起到降低氧化应激的作用，具体结果见表2。

表2 老鹳草素对血清中氧化应激因子MDA、GSH-Px、SOD水平的影响

3.5 老鹳草素对免疫性肝损伤小鼠组织中炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的影响

与正常组相比，模型组小鼠组织中炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平显著升高，差异均具有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较，老鹳草素中、高剂量组小鼠组织炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平均显著下降，差异均具有统计学意义(P<0.01或P<0.05)，显示其具有抑制肝脏炎症反应的作用。具体结果见表3。

表3 老鹳草素对肝组织中炎症因子IL-1β，IL-6及TNF-α表达水平的影响

3.6 老鹳草素对免疫性肝损伤小鼠肝组织中JNK信号通路中蛋白的表达的影响

WB实验结果显示：与正常组比较，模型小鼠肝脏内p-ASK1/ASK1、p-MKK4/MKK4、p-JNK/JNK以及p-c-Jun/c-Jun的比值明显上调，数据表明均有显著性差异(P<0.01)。与模型组相比，老鹳草素中、高剂量组能显著抑制p-ASK1/ASK1、p-MKK4/MKK4、p-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun比值的上调，差异均具有统计学意义(P<0.01)，初步显示老鹳草素对免疫性肝损伤小鼠肝组织中的JNK信号通路具有调控作用。具体结果见图2。

图2 老鹳草素对免疫性肝损伤小鼠肝组织中JNK信号通路的影响

4 讨论

肝脏富含各种酶，ALT和AST是最常见的两种，一般地，肝组织中转氨酶的含量是血液的100倍，1%肝细胞损伤，血清中转氨酶的水平就增加1倍，这是反馈出肝损伤的最早和最敏感的标志之一[9,10]。ALP和TBIL被认为是临床判断肝损伤的重要指标[9]。SOD是体内抗氧化系统中重要的酶系抗氧化剂，经反应生成氧气和过氧化氢而清除体内氧自由基，从而抑制后续的脂质过氧化反应[11]。MDA是过氧化作用的终产物，严重威胁细胞膜结构的完整性，使细胞肿胀、坏死[12]，组织中MDA的含量高低可间接反映肝脏受自由基攻击时的破坏程度[11]。GSH不仅是体内新陈代谢的重要物质和最重要的还原性物质，还是GSH-Px的底物，能消除氧自由基和超氧阴离子等有毒物质，阻止过氧化物入侵细胞膜[13]。由实验结果中可见，本实验由LPS诱导的免疫性肝损伤小鼠血清ALT、AST、ALP、TBIL以及MDA水平显著上升，SOD和GSH-Px活力明显降低，这与Chou等[8]报道一致。老鹳草素处理后，小鼠血清中肝功能因子ALT、AST、ALP、TBIL以及氧化应激指标MDA水平下降，SOD和GSH-Px活力明显上升。根据以上实验结果，我们推测老鹳草素防治免疫性肝损伤与抑制转氨酶升高、抗氧化作用有关。

IL-1β是炎症反应中的关键性靶点，虽无法直接对肝脏造成损伤，但是高浓度的IL-1β能诱导炎性细胞与免疫细胞产生一系列细胞炎症因子，从而引起炎症反应以及错误的免疫应答[14]。TNF-α的产生具体机制为肝损伤发生后，细胞膜通透性増加，促使Ca2+内流，活化库普弗细胞，导致TNF-α的大量分泌，加重肝脏的损伤程度[15]。同时，局部组织发生炎症细胞浸润，TNF-α可诱导IL-6生成，IL-6可作为TNF-α的第二介质发挥作用，导致肝内大量细胞变性坏死，发生重型肝炎[16]。在本研究中，给予LPS造模后，小鼠肝脏组织中的IL-1β、TNF-α和IL-6水平显著增高。这些指标数据的升高趋势与Dong等[17]相同，与正常组比较均具有显著性差异。有趣的是，通过老鹳草素的治疗可以显著性逆转LPS诱导的这些变化，主要表现为降低组织中IL-1β、TNF-α和IL-6水平，缓解炎症反应。这些结果均表明，老鹳草素尚可通过抗炎作用来防治免疫性肝损伤。

JNK是MAPKs通路中的主要成员之一，参与信号转导、炎症反应、细胞凋亡等过程[18]。在细胞静止状态下，JNK主要位于细胞质，经上游信号系列氨基酸残基磷酸化修饰的级联反应而激活后，胞浆中的JNK移位到细胞核使JNK完全活化并具有酶催化活性，参与细胞调控[19]。进一步的研究表明，JNK通路被激活后，细胞出现损伤，最终引发凋亡[20]。值得注意的是，JNK被抑制后，细胞损伤和凋亡同样受到抑制[21]。ASK1位于JNK通路的上游，正常生理状态下与相应的蛋白结合形成复合物，而处于病理状态时，ASK1能通过MAP2K(如MKK4和MKK7)在苏氨酸183和酪氨酸185的双重磷酸化激活[22]。尚有实验证明ASK1过表达可诱导肝细胞凋亡，而沉默ASK1可抑制细胞凋亡[23]。c-Jun位于JNK信号通路的下游，活化的JNK可进一步使c-Jun发生磷酸化，在细胞的信号转导、增殖、凋亡等生命进程中发挥重要作用[24]。此外，临床上已将c-Jun视为炎症反应、癌症等多种疾病的研究靶点[25]。在本实验中，与正常组相比，模型组中p-ASK1/ASK1、p-MKK4/MKK4、p-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun的比值均呈现升高趋势，提示JNK通路被激活；老鹳草素各剂量组组织中p-ASK1/ASK1、p-MKK4/MKK4、p-JNK/JNK以及p-c-Jun/c-Jun的比值较模型组均有不同程度的下调，证明老鹳草素抑制了JNK的活化及JNK信号通路中关键蛋白的表达，减弱肝细胞凋亡活动。

综上所述，老鹳草素能抑制升高的转氨酶、氧化应激水平和炎症反应，并可调控JNK信号通路，减弱凋亡活动，显示其可明显改善免疫性肝损伤。