沈波 张浩 毛爽 王立斌 李雪薇

【摘要】 目的：探討柴胡皂苷D（SSD）对非小细胞肺癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响及其对VEGF/VEGFR2信号通路的调控作用。方法：体外培养人非小细胞肺癌细胞A549，分别加入不同浓度（5、10、20 μmol/L）的SSD处理48 h，记作SSD-L组、SSD-M组、SSD-H组，分别将pcDNA、pcDNA-VEGF转染至A549细胞后加入SSD处理细胞（SSD-H+pcDNA组、SSD-H+pcDNA-VEGF组）;采用CCK-8法与平板克隆形成实验检测细胞增殖能力;采用Transwell小室实验检测细胞迁移及侵袭能力;检测葡萄糖消耗、乳酸水平;采用Western blot法检测VEGF、VEGFR2、p-MEK、p-ERK、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表达量。结果：与Con组比较，SSD可明显降低细胞活力与葡萄糖消耗、乳酸水平及N-cadherin、Vimentin、VEGF、VEGFR2、p-MEK、p-ERK蛋白水平（P<0.05），减少克隆形成数、迁移及侵袭细胞数（P<0.05），提高E-cadherin蛋白水平（P<0.05）。与SSD-H+pcDNA组比较，转染pcDNA-VEGF可明显提高细胞活力、葡萄糖消耗及乳酸水平（P<0.05），增加克隆形成数、迁移及侵袭细胞数（P<0.05），降低E-cadherin蛋白水平（P<0.05），提高VEGF、VEGFR2、p-MEK、p-ERK、N-cadherin、Vimentin蛋白水平（P<0.05）。结论：柴胡皂苷D可通过抑制VEGF/VEGFR2信号通路的激活从而抑制非小细胞肺癌细胞增殖、迁移及侵袭。

【关键词】 柴胡皂苷D VEGF/VEGFR2信号通路 非小细胞肺癌 增殖 迁移 侵袭

[Abstract] Objective： To explore the effect of Saikasaponin D （SSD） on the proliferation， migration and invasion of non-small cell lung cancer cells and its regulation on VEGF/VEGFR2 signaling pathway. Method： Human non-small cell lung cancer cells A549 were cultured in vitro and SSD-treated 48 h， writed for SSD-L group， SSD-M group， and SSD-H group with different concentration （5， 10， 20 μmol/L） were added respectively. pcDNA and pcDNA-VEGF were transfected into A549 cells and SSD-treated cells， writed for SSD-H+pcDNA group， SSD-H+pcDNA-VEGF group were added into the A549 cells. CCK-8 assay and plate clone formation assay were used to detect the proliferation ability of cells. Transwell chamber assay was used to detect cell migration and invasion ability. Glucose consumption and lactic acid levels were detected. The protein expression levels of VEGF， VEGFR2， p-MEK， p-ERK， E-cadherin， N-cadherin and Vimentin were detected by Western blot. Result： Compared with Con group， SSD significantly decreased cell viability， glucose consumption， lactate level and protein levels of N-cadherin， Vimentin， VEGF， VEGFR2， p-MEK and p-ERK （P<0.05）， decreased the number of clone formation， migration and invasion cells （P<0.05）， and increased the protein level of E-cadherin （P<0.05）. Compared with SSD-H+pcDNA group， pcDNA-VEGF transfection significantly increased cell viability， glucose consumption and lactate levels （P<0.05）， increased the number of clone formation， migration and invasion cells （P<0.05）， decreased the protein levels of E-cadherin （P<0.05）， and increased the protein levels of VEGF， VEGFR2， p-MEK， p-ERK， N-cadherin and Vimentin （P<0.05）. Conclusion： Saikasaponin D can inhibit the proliferation， migration and invasion of non-small cell lung cancer cells by inhibiting the activation of VEGF/VEGFR2 signaling pathway.

[Key words] Saikasaponin D VEGF/VEGFR2 signaling pathway Non-small cell lung cancer Proliferation Migration Invasion

First-authors address： Peoples Hospital of Shenyang Economic and Technological Development Zone， Shenyang 110000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.08.006

肺癌是威胁人类生命安全的恶性肿瘤之一，我国肺癌发病率逐年上升，其中非小细胞肺癌占据肺癌的80%左右，已严重影响患者的生活质量，目前肺癌的治疗手段已取得明显进步，但患者的5年生存率仍然较低，且患者预后仍然很差，其主要原因在于肺癌细胞的高度迁移及侵袭能力[1]。因而如何抑制非小细胞肺癌细胞转移成为研究重点。中草药及其提取物具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等作用，既往研究显示，部分中草药可抑制肺癌细胞增殖、迁移及侵袭，并可有效减缓肿瘤发展进程，但关于其作用机制尚未阐明[2-4]。柴胡皂苷D（Saikasaponin D， SSD）是柴胡的主要活性成分，且具有抗癌作用[5]。但关于柴胡皂苷D对非小细胞肺癌的抑制作用及其可能作用机制尚未阐明。肿瘤血管生成主要包括内皮细胞增殖、迁移、基底膜降解等，其中血管内皮生长因子（VEGF）与血管内皮细胞生长因子受体2（VEGFR2）属于促血管生成因子，并可促进内皮细胞增殖及迁移，从而促进肺癌等肿瘤发生及发展[6]。但柴胡皂苷D是否通过调控VEGF/VEGFR2信号通路而发挥抗肺癌作用尚未可知。因此，本研究于2019年1月-2020年2月主要探讨柴胡皂苷D对非小细胞肺癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响，探究其对VEGF/VEGFR2信号通路的调控作用。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 柴胡皂苷D购自美国Sigma公司;人非小细胞肺癌细胞A549购自美国ATCC细胞库;葡萄糖消耗与乳酸水平检测试剂盒购自美国BioVision公司;DMEM培养基与FBS购自美国Gibco公司;Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司;pcDNA3.1购自上海远慕生物科技有限公司;CCK-8检测试剂盒购自南京固与生物有限公司;Transwell小室购自南京迅贝生物科技有限公司;Matrigel基质胶购自武汉安特捷生物技术有限公司;兔抗人E-cadherin、N-cadherin、Vimentin抗体购自美国Santa Cruz公司;兔抗人VEGF、VEGFR2抗体购自美国Abcam公司;兔抗人p-MEK、p-ERK抗体购自美国CST公司;辣根过氧化物酶（HRP）標记的山羊抗兔二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 A549细胞常规培养，待细胞生长融合度达到80%时进行传代培养。取对数生长期A549细胞接种于96孔板（5×103个/孔），分别加入不同浓度（5、10、20 μmol/L）的柴胡皂苷D处理48 h[7]，分别记作SSD-L组、SSD-M组、SSD-H组。分别将pcDNA、pcDNA-VEGF转染至A549细胞，加入含有浓度为20 μmol/L柴胡皂苷D的培养基培养48 h，分别记作SSD-H+pcDNA组、SSD-H+pcDNA-VEGF组。同时将正常培养的细胞作为Con组。

1.2.2 CCK-8法检测细胞增殖 取各组对数生长期A549细胞接种于96孔板（1×104个/孔），每孔加入10 μL CCK-8溶液，继续培养2 h，应用酶标仪检测波长在450 nm处的光密度值（OD值）。实验重复3次，每组实验设置3个复孔。

1.2.3 平板克隆形成实验 取各组A549细胞接种于6孔板（1×103个/孔）中，置于培养箱继续培养，每隔2 d更换一次培养液，直至出现肉眼可见的细胞克隆，培养时间为14 d，弃培养液，PBS洗涤，加入4%多聚甲醛固定15 min，采用0.1%结晶紫染液染色20 min，洗涤，风干，应用荧光显微镜观察克隆形成数。实验重复3次，每组实验设置3个复孔。

1.2.4 Transwell实验检测细胞迁移与侵袭 采用Transwell小室实验检测细胞迁移及侵袭能力，迁移实验与侵袭实验相同实验步骤：取各组A549细胞加入上室（3×104个/室），下室加入含有FBS的培养液（600 μL/室），置于培养箱继续培养24 h，弃培养液，分别采用多聚甲醛固定与结晶紫染色液染色，应用显微镜观察迁移及侵袭细胞数。不同之处：侵袭实验前需稀释Matrigel基质胶，将Matrigel基质胶稀释液加入小室的上室（40 μL/室）。实验重复3次，每组实验设置3个复孔。

1.2.5 检测糖酵解中葡萄糖消耗与乳酸水平 采用乳酸脱氢酶比色法检测细胞培养液中的乳酸水平，采用葡萄糖检测试剂盒说明书检测葡萄糖消耗，严格按照试剂盒说明书进行操作。实验重复3次，每组实验设置3个复孔。

1.2.6 蛋白免疫印迹（Western blot）检测VEGF、VEGFR2、p-MEK、p-ERK、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表达 提取各组A549细胞总蛋白，采用BCA法检测蛋白浓度，蛋白变性，SDS-PAGE分离蛋白，转膜，封闭2 h，分别加入一抗稀释液（1︰1 000）与二抗稀释液（1︰5 000），室温孵育1 h，滴加ECL，暗室内曝光显影，应用ImageJ软件分析各条带灰度值。实验重复3次，每组实验设置3个复孔。

1.3 统计学处理 采用SPSS 21.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，两组间比较采用t检验，多组数据比较采用单因素方差分析;计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 柴胡皂苷D对A549细胞增殖能力的影响 与Con组比较，SSD-L组、SSD-M组、SSD-H组细胞活力均显著降低（P<0.05），克隆形成数均显著减少（P<0.05），且SSD-L组、SSD-M组、SSD-H组各指标比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 柴胡皂苷D对A549细胞迁移、侵袭能力的影响及相关蛋白表达量 与Con组比较，SSD-L组、SSD-M组、SSD-H组迁移及侵袭细胞数均显著减少（P<0.05），E-cadherin蛋白水平显著升高（P<0.05），N-cadherin、Vimentin蛋白水平均显著降低（P<0.05），且SSD-L组、SSD-M组、SSD-H组各指标比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图1、2和表2。

2.3 柴胡皂苷D对A549细胞糖酵解水平的影响 与Con组比较，SSD-L组、SSD-M组、SSD-H组葡萄糖消耗、乳酸水平均显著降低（P<0.05），且SSD-L组、SSD-M组、SSD-H组各指标比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表3。

2.4 柴胡皂苷D对A549细胞中VEGF、VEGFR2、p-MEK、p-ERK蛋白表达量的影响 与Con组比较，SSD-L组、SSD-M组、SSD-H组的VEGF、VEGFR2、p-MEK、p-ERK蛋白水平均显著降低（P<0.05），且SSD-L组、SSD-M组、SSD-H组各指标比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图3、表4。

2.5 转染pcDNA-VEGF可逆转柴胡皂苷D对A549细胞增殖、迁移、侵袭及糖酵解水平的抑制作用 与SSD-H+pcDNA组比较，SSD-H+pcDNA-VEGF组细胞活力、葡萄糖消耗及乳酸水平均显著升高（P<0.05），克隆形成数、迁移及侵袭细胞数均显著增多（P<0.05）。见表5。

2.6 各组VEGF、VEGFR2、p-MEK、E-cadherin、p-ERK、N-cadherin、Vimentin蛋白表达量 与SSD-H+pcDNA组比较，SSD-H+pcDNA-VEGF组E-cadherin蛋白水平显著降低（P<0.05），VEGF、VEGFR2、p-MEK、p-ERK、N-cadherin、Vimentin蛋白水平均显著升高（P<0.05），见表6、图4。

3 讨论

非小细胞肺癌治疗方式多样化，但化疗等方式具有一定毒副作用，因而寻找安全有效的治疗方式对改善患者预后具有重要意义，既往研究显示，中草药可有效抑制肺癌细胞迁移及侵袭，同时相关报道指出VEGF/VEGFR2信号通路在肺癌发生及发展过程中发挥重要调控作用，并可能作为肺癌治疗靶点[8-10]。

柴胡皂苷D是从柴胡根茎中分离出的三萜皂苷，并可抑制乳腺癌、胃癌等肿瘤细胞增殖及分裂，促进细胞凋亡，还可逆转肿瘤细胞多药耐药性[11-12]。柴胡皂苷D可抑制肺癌移植瘤生长，但关于其作用机制尚未阐明[13]。柴胡皂苷D可抑制mTORC信号转导通路的活化从而促进肝癌细胞自噬及凋亡[14]。与上述研究结果相似，本研究结果显示，不同浓度的柴胡皂苷D处理后可明显降低细胞增殖能力，并可减少迁移及侵袭细胞数，且呈剂量依赖性，提示柴胡皂苷D可抑制非小细胞肺癌细胞增殖、迁移及侵袭能力。有研究表明上，皮-间质转化与肿瘤细胞转移密切相关，其中E-cadherin属于上皮细胞标志物，N-cadherin、Vimentin属于间充质细胞标志物，E-cadherin表达下调可促进N-cadherin、Vimentin表达从而促进上皮-间质转化最终促进细胞转移[15]。本研究结果显示，柴胡皂苷D处理后E-cadherin蛋白水平升高，而N-cadherin、Vimentin蛋白水平降低，且呈剂量依赖性，提示柴胡皂苷D可能通过调控上皮-间质转化从而抑制非小细胞肺癌细胞迁移及侵袭。肿瘤细胞发生糖酵解时葡萄糖消耗后产生乳酸，此过程产生的ATP较少导致糖酵解活性升高，进而促进肿瘤细胞增殖及迁移[16-17]。本研究结果显示柴胡皂苷D可明显降低非小细胞肺癌细胞中葡萄糖消耗、乳酸水平，且随着药物剂量的增加而显著降低，提示柴胡皂苷D可能通过降低糖酵解水平从而抑制非小细胞肺癌细胞增殖、迁移及侵袭。

血管生成与内皮细胞增殖、迁移等密切相关，抑制血管生成是抑制肿瘤进展的重要途径，VEGF/VEGFR2信号通路可调节内皮细胞增殖、迁移及侵袭，VEGF可结合VEGFR2而促进VEGFR2磷酸化，激活下游信号级联反应，主要包括MEK/ERK信号通路等，MEK、ERK属于丝裂原活化蛋白激酶家族，其在细胞增殖、分化等生物学过程中发挥重要调控作用，并可作为VEGF/VEGFR2信号通路的下游基因進而参与血管生成过程[18-20]。本研究结果显示不同剂量的柴胡皂苷D处理后VEGF、VEGFR2、p-MEK、p-ERK蛋白水平降低，且随着药物剂量的增加而显著降低，提示柴胡皂苷D可能通过抑制VEGF/VEGFR2信号通路从而发挥抗非小细胞肺癌作用。同时本研究将pcDNA-VEGF与柴胡皂苷D联合处理非小细胞肺癌细胞，结果显示细胞活力、葡萄糖消耗及乳酸水平升高，克隆形成数、迁移及侵袭细胞数增多，VEGF、VEGFR2、p-MEK、p-ERK、N-cadherin、Vimentin表达上调，而E-cadherin表达下调，提示VEGF过表达可明显降低柴胡皂苷D对非小细胞肺癌细胞增殖、迁移及侵袭的抑制作用。

综上所述，柴胡皂苷D可通过抑制VEGF/VEGFR2信号通路的活化从而抑制非小细胞肺癌细胞增殖、迁移及侵袭，可为进一步阐释柴胡皂苷D抗肿瘤作用机制奠定实验基础，但关于其具体作用机制仍需进一步探究。

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（收稿日期：2021-01-22） （本文编辑：姬思雨）