杨天真 杨 军 邱瑞成 王春梅

(四川省绵竹市人民医院病理科，绵竹市 618200，电子邮箱：yangs_book@163.com)

非小细胞肺癌约占全球癌症死因的80%，发病率及死亡率均居恶性肿瘤首位[1]。部分非小细胞肺癌患者确诊时已为中晚期，已经不能进行手术治疗，化疗或放疗是治疗此类患者的主要方法。因体质的差异，不同患者对放疗、化疗的敏感性存在很大差异，根据生物标记物为患者选择合适的治疗方案不但可以提高疗效，还可以减少不必要的毒副作用[2]。BRCA1蛋白是一种抑癌因子，参与恶性肿瘤的发生和发展，临床上常用于非小细胞肺癌的诊断和预后判断[3]。人线粒体转录终止因子3(human mitochondrial transcription termination factor 3，hMTERF3)基因编码的蛋白质，属于一种负调控细胞因子，可以在细胞内结合启动子的序列元件，抑制基因转录，降低线粒体呼吸链酶活性[4]。本研究探究BRCA1和hMTERF3在非小细胞肺癌组织中的表达情况及其与患者病理特征的相关性，旨在为非小细胞肺癌患者的治疗提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2017年10月至2018年10月在我院接受手术治疗的70例非小细胞肺癌患者作为研究对象。纳入标准：所有患者均经过手术病理确诊；所有患者均符合2014版《NCCN非小细胞肺癌临床实践指南》[5]的诊断标准。排除标准：病历资料不全者；心肾肺等功能不完全者；心脑血管疾病患者；并发其他恶性肿瘤患者。其中男性38例、女性32例，年龄48～69(57.3±7.6)岁；病理分期Ⅰ期12例，Ⅱ期22例，Ⅲ期20例，Ⅳ期16例。

1.2 研究方法

1.2.1 标本制作：术中留取癌组织标本以及距离癌组织5 cm以上的癌旁组织标本，使用4%中性福尔马林固定后行常规石蜡包埋，厚度为3 cm，连续切片作免疫组化标记。

1.2.2 免疫印迹法检测BRCA1、hMTERF3蛋白表达水平：取癌组织与癌旁组织标本，磷酸缓冲盐溶液清洗标本3次后，采用分离缓冲液裂解0.5 h获取蛋白，测定蛋白浓度。以20 μg/孔蛋白质上样，进行十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束进行转膜，用10%的牛奶将转有蛋白的膜在摇床上常温封闭1.5 h；BRCA1(Abgent公司，批号：A-AO1812a，)、hMTERF3(Abnova公司，批号：H00050650-M)一抗孵育(稀释比均为1 ∶1 000)37℃过夜，TBST洗膜后室温孵育BRCA1、hMTERF3二抗(Hycult公司，批号：HM1002-01、HM1002-08；稀释比均为1 ∶5 000)1 h，TBST洗膜后，加入显影剂显色(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，批号：WB-0312)，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)为内参，采用凝胶图像处理系统分析目的蛋白的相对表达量。

1.2.3 免疫组化染色：将待测标本进行脱蜡、水化后，浸泡在95℃ 0.01 mol/L的枸橼酸缓冲液中，并进行热修复，3%的H2O2培育20 min后，滴入山羊血清10 min后进行封闭，在25℃～27℃环境下孵育30 min，弃封闭液，加入BRCA1(Abgent公司，批号：A-AO1812a)、hMTERF3(Abnova公司，批号：H00050650-M)一抗，5℃孵育过夜，次日加入BRCA1、hMTERF3二抗(Hycult公司，批号：HM1002-01，HM1002-08)，37℃恒温箱中孵育30 min，磷酸缓冲盐溶液冲洗后进行二氨基联苯胺显色、脱水、封片处理。所有病理切片均由2位以上经验丰富的医师采用双盲法进行观察并作出诊断。随机选择5个视野，根据染色程度和染色细胞百分比进行评估：阳性细胞数<10%为(-)，10%～25%为(+)，>25%～75%为(++)，>75%为(+++)。

1.3 统计学分析 采用SPSS 21.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，两组间比较采用两独立样本t检验或配对t检验，多组比较采用方差分析；计数资料以例数表示。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 癌组织和癌旁组织中BRCA1、hMTERF3蛋白表达水平的比较 BRCA1蛋白主要表达于细胞核，阳性表现呈棕褐色或浅褐色；hMTERF3主要表达于细胞质，阳性表现为棕褐色或褐色。癌组织中BRCA1、hMTERF3蛋白相对表达水平均高于癌旁组织(均P<0.05)，见表1和图1、图2。

表1 癌组织、癌旁组织中BRCA1、hMTERF3蛋白相对表达水平的对比(x±s)

图1 BRCA1和hMTERF3蛋白在癌组织及癌旁组织中的表达

图2 癌组织及癌旁组织中BRCA1和hMTERF3蛋白的免疫组化染色结果(×200)注：图A、B分别为癌组织中BRCA1和hMTERF3蛋白癌旁组织的BRCA1检测免疫组织化结果，图C、D分别为癌组织、癌旁组织的hMTERF3检测免疫组化结果。

2.2 不同病理特征患者癌组织中BRCA1、hMTERF3蛋白表达水平比较 侵及浆膜、肿瘤体积≥5 cm3、病理分期为Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴结转移、低分化的患者BRCA1、hMTERF3蛋白相对表达水平分别高于未侵及浆膜、肿瘤体积<5 cm3、病理分期为Ⅰ+Ⅱ期、无淋巴结转移、中或高分化的患者(均P<0.05)，见表2。

表2 不同病理特征患者癌组织中BRCA1、hMTERF3蛋白相对表达水平的比较(x±s)

3 讨 论

据最新统计结果显示，肺癌的发病率、死亡率位居全球癌症首位[6-7]，严重影响人类健康。在我国，肺癌属于高发病，发病率、死亡率一直居高不下，在癌症死亡病因中位居第一，并且发病呈年轻化趋势[8]。非小细胞肺癌占所有肺癌的85%[9]，但部分非小细胞肺癌患者在确诊时已经属于晚期，手术切除已经无法有效根治，只能通过化疗或放疗改善患者症状[10]。但因个体差异，术后辅助化疗、放疗或单独化疗、放疗的个体获益有所不同[11-12]。寻找肺癌放疗、化疗的敏感性和耐药性相关基因，有助于对肺癌患者进行个体化治疗，从而减少毒副作用、提高治疗效果[13-14]。

有研究显示，BRCA1、表皮生长因子受体、胸苷酸合成酶等分子标志物在预测非小细胞肺癌放疗、化疗敏感性等方面具有重要意义，在指导非小细胞肺癌患者个体化治疗中发挥着重要作用[15]。BRCA1基因作为转录调控基因，C末端有酸性氨基酸，N末端有锌指结构区，是一种与双链DNA损伤修复相关的抑癌基因[16]。BRCA1基因所编码的蛋白在DNA的损伤修复中扮演着重要角色，参与基因的转录调节、细胞凋亡、周期调控等过程[17]。在评估非小细胞肺癌化疗药物的疗效时，BRCA1表达水平是非常重要的参考指标。有研究显示，化疗药物的疗效与BRCA1表达水平有关，如BRCA1基因呈低表达的肺癌患者对铂类药物较为敏感，BRCA1基因呈高表达时则机体易耐药[18]。因此，了解BRCA1因子的特点及其在非小细胞肺癌中的表达情况，对选择敏感的化疗药物有重要意义[19]。

hMTERF3基因定位于人类第8号染色体长臂，是唯一一个人类线粒体转录终止因子，其由10个内含子和11个外显子组成[20]。hMTERF3基因编码的蛋白产物共有417个氨基酸，其在人类恶性肿瘤、线粒体糖尿病、神经退行性疾病等线粒体相关疾病的诊断与治疗中均具有重要的临床意义[21]。

本研究结果显示，相较于癌旁组织，非小细胞肺癌组织中BRCA1、hMTERF3呈现异常高表达，肿瘤体积大、侵及浆膜、病理分期为Ⅲ及Ⅳ期、有淋巴结转移、低分化的非小细胞肺癌患者BRCA1、hMTERF3蛋白相对表达水平更高(P<0.05)，说明BRCA1、hMTERF3可能与非小细胞肺癌的发生和发展密切相关。

综上所述，BRCA1、hMTERF在非小细胞肺癌组织中呈现异常高表达，且与病理参数具有一定相关性，两者或在非小细胞肺癌的发生和发展中发挥重要作用。