张先元 陈强 章正祥 周会霞 邵敏峰 黄春华

不安腿综合征（RLS）是一种严重影响生活的中枢神经系统疾病，最典型的症状是有强烈活动双腿的愿望，还常伴有肢体麻木、疼痛等不适感。目前认为脊髓多巴胺能传递的减少可导致RLS［1］。临床上使用多巴胺能拮抗剂可使病情加重，激动多巴胺D2受体（DRD2）、多巴胺D3受体（DRD3）可改善症状。研究发现中脑导水管周围灰质（PAG）和防御行为、疼痛密切相关［2-4］。本研究旨在探索RLS大鼠模型上PAG多巴胺D2受体的变化。

1 材料与方法

1.1 组织来源 雄性SD大鼠随机分成空白组（n=3）、假手术组（n=6）、模型组（n=6）。对右侧A11进行药物注射，第8天进行行为学录制和脑组织取材［5］。

1.2 主要试剂 小鼠抗大鼠TH单克隆抗体（T1299），Sigma-Aldrich；兔抗大鼠D2多克隆抗体（324393），Calbiochem；山羊抗兔IgG/HRP 聚合物（PV-6001），北京中杉金桥生物技术有限公司；山羊抗小鼠IgG/HRP聚合物（PV-6002），北京中杉金桥生物技术有限公司；DAB（ZLI-9018），北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 仪器 冰冻切片机（HM 550），德国美康仪器设备有限公司；数字切片扫描仪（Pannoramic MIDI II），3DHISTECH。

1.4 免疫组化 （1）切片制备：根据《大鼠脑立体定位图谱》（第6版）分别对A11、中脑导水管周围灰质（PAG）进行定位。在-20℃的恒温箱中连续切片，A11厚度为30 μm，每隔5张取1张，共6套，每套12～15张，PAG厚度40 μm，隔3张取1张，取3张切片，收集于0.01M PBS液中，于4℃保存。（2）免疫组化漂片法：吸干PBS液，3% H2O2室温孵育15 min；PBS液摇床漂洗3 min，共3次；加入含有0.3% Triton X-100的PBST液孵育30 min；吸干PBST液，加一抗，4 ℃孵育过夜；PBS液摇床漂洗10 min，共3次；加入二抗聚合物，37℃孵育20 min；PBS液摇床漂洗10 min，共3次；DAB溶液现用现配，避光显色5～10 min；PBS液摇床漂洗5 min，共3次；贴片，37 ℃烘干；85%、90%、95%、95%、100%、100%乙醇梯度脱水各2 min；二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各透明2 min；中性树胶封片。A11加小鼠抗大鼠TH单克隆抗体（1∶2000）和山羊抗小鼠IgG/HRP聚合物，PAG加兔抗大鼠D2多克隆抗体（1∶4000）和山羊抗兔IgG/HRP 聚合物。

1.5 图片分析 （1）每只大鼠取第一和第四套A11切片进行染色。所有A11切片在同一物镜（×4）下用显微成像系统进行照片采集。剔除只含黑质、A13等部位的切片，每套最终取6张含A11部位的切片（以mt、fr及第三脑室等为参考标志），人工计数A11部位表达TH多巴胺神经元的数目，并分左右进行统计。（2）利用数字切片扫描仪对组织切片进行数字化扫描，以《大鼠脑立体定位图谱》第6版为参考，对导水管周围灰质外侧（LPAG）放大40倍后选取一张图像进行分析。人工计数多巴胺D2受体阳性表达的细胞数量，并分左右进行统计。单侧A11多巴胺神经元数量=12张切片同侧A11多巴胺神经元数量之和，毁损率=1-单侧A11多巴胺神经元数量/空白组同侧A11多巴胺神经元数量的均值，毁损率若为负数，则记为0，如果毁损组毁损率＜20%，假手术组≥20%，则予以剔除。其中1个假手术组样本碎裂，1个假手术组样本右侧A11毁损率＞20%（同批次动物本研究团队行A11毁损率检测，大部分假手术组右侧A11毁损率＜20%），两个样本均予以剔除，剩余13个样本。模型组、假手术组各取3个样本，与空白组匹配。

1.6 统计学方法 采用SPSS 25.0统计软件。计量资料符合正态分布，以（±s）表示，方差齐者采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法，方差不齐者采用Games-Howell统计法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 行为学及A11毁损结果 毁损组右侧A11多巴胺神经元毁损率明显高于对侧和假手术组右侧，差异均有统计学意义（P＜0.01），表明A11毁损是成功的，并且毁损一侧A11多巴胺神经元的同时还会引起对侧A11多巴胺神经元的减少。毁损组第3 h的爬笼时间高于假手术组，差异有统计学意义（P＜0.05），而其余时间段和指标均无明显差异，表明在11∶00-12∶00时间段，毁损组的运动活性有所增高。

2.2 多巴胺D2受体阳性表达的细胞数量及比较 LPAG左侧及右侧中多巴胺D2受体阳性细胞组间均有明显差异。见表1。免疫组化结果见图1、2。

表1 LPAG中多巴胺D2受体阳性细胞数量的比较（±s）

注：与模型组比较，*P＜0.05，#P＜0.01

指标部位 组别 n LPAG右侧 左侧DRD2 模型组 3 42.00±1.33 42.67±2.19假手术组 3 26.89±0.69# 26.78±0.51#正常组 3 33.33±7.94 33.11±6.29*F值 7.930 12.902 P值 0.021 0.007

图1 -1空白组LPAG左侧DRD2（×40）

图1 -2假手术组LPAG左侧DRD2（×40）

图1 -3模型组LPAG左侧DRD2（×40）

图2 -1空白组LPAG右侧DRD2（×40）

图2 -2假手术组LPAG右侧DRD2（×40）

图2 -3模型组LPAG右侧DRD2（×40）

3 讨论

A11核团从PAG最前端开始延伸至下丘脑背侧尾侧，内侧延伸至乳头丘脑束［6］，是A8-A16多巴胺能细胞群中唯一对脊髓进行神经支配的核团［1］，通过毁损A11核团可制备 RLS模型［7］。

有学者认为动物的防御行为和DMPAG、DLPAG、LPAG有关［2］，若兴奋尾侧的LPAG可引起以肢体肌肉剧烈活动为主要特征的逃跑反应［3］。DRD2可对运动活性、疼痛产生影响［8］。对A11进行电刺激，可通过三叉神经颈复合体上的DRD2抑制疼痛信息，对A11毁损后，在三叉神经颈复合体上可见共同表达DRD2和5-HT1B/1D受体［9］，本课题组发现A11毁损后这两种受体同时也存在PAG上［5］。PAG可能是内源性疼痛调节的最重要部位［4］，PAG传递的感觉信号受到多巴胺D1和D2样受体的调节［10］。

多巴胺受体对多巴胺进行负反馈调节，当突触中多巴胺含量减少时可激活突触前膜D2自身受体，进而导致轴突末端多巴胺浓度增加［11］。动物研究表明D2受体拮抗剂或多巴胺浓度降低可以上调D2受体表达，而D2受体激动剂的慢性刺激可降低受体浓度，RLS病人D2受体密度增加可能与多巴胺能神经传递功能减退后引起受体表达上调有关［12］。

本研究发现RLS模型组大鼠双侧LPAG中多巴胺D2受体明显增高，可能也是毁损A11后导致多巴胺合成减少进而引起多巴胺D2受体表达上调，LPAG双侧都受影响可能的原因：（1）毁损一侧A11后引起对侧A11多巴胺神经元减少，影响到双侧A11多巴胺下行通路。（2）三叉神经脊束核尾侧亚核是三叉神经颈复合体重要组成部分，A11对三叉神经脊束核尾侧亚核进行双侧投射［13］，而LPAG接受三叉神经脊束核的神经投射［2］。本研究仍有较多不足，需扩大样本量进一步研究A11多巴胺神经具体如何下行。