张先元 陈强 章正祥 周会霞 邵敏峰 黄春华

不安腿综合征（RLS）是一种严重影响生活的中枢神经系统疾病，最典型的症状是有强烈活动双腿的愿望，还常伴有肢体麻木、疼痛等不适感。目前认为脊髓多巴胺能传递的减少可导致RLS［1］。临床上使用多巴胺能拮抗剂可使病情加重，激动多巴胺D2受体（DRD2）、多巴胺D3受体（DRD3）可改善症状。研究发现中脑导水管周围灰质（PAG）和防御行为、疼痛密切相关［2-4］。本研究旨在探索RLS大鼠模型上PAG多巴胺D2受体的变化。

1 材料与方法

1.1 组织来源 雄性SD大鼠随机分成空白组（n=3）、假手术组（n=6）、模型组（n=6）。对右侧A11进行药物注射，第8天进行行为学录制和脑组织取材［5］。

1.2 主要试剂 小鼠抗大鼠TH单克隆抗体（T1299），Sigma-Aldrich；兔抗大鼠D2多克隆抗体（324393），Calbiochem；山羊抗兔IgG/HRP 聚合物（PV-6001），北京中杉金桥生物技术有限公司；山羊抗小鼠IgG/HRP聚合物（PV-6002），北京中杉金桥生物技术有限公司；DAB（ZLI-9018），北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 仪器 冰冻切片机（HM 550），德国美康仪器设备有限公司；数字切片扫描仪（Pannoramic MIDI II），3DHISTECH。

1.4 免疫组化 （1）切片制备：根据《大鼠脑立体定位图谱》（第6版）分别对A11、中脑导水管周围灰质（PAG）进行定位。在-20℃的恒温箱中连续切片，A11厚度为30 μm，每隔5张取1张，共6套，每套12～15张，PAG厚度40 μm，隔3张取1张，取3张切片，收集于0.01M PBS液中，于4℃保存。（2）免疫组化漂片法：吸干PBS液，3% H2O2室温孵育15 min；PBS液摇床漂洗3 min，共3次；加入含有0.3% Triton X-100的PBST液孵育30 min；吸干PBST液，加一抗，4 ℃孵育过夜；PBS液摇床漂洗10 min，共3次；加入二抗聚合物，37℃孵育20 min；PBS液摇床漂洗10 min，共3次；DAB溶液现用现配，避光显色5～10 min；PBS液摇床漂洗5 min，共3次；贴片，37 ℃烘干；85%、90%、95%、95%、100%、100%乙醇梯度脱水各2 min；二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各透明2 min；……