蒋智文，谢汶蓉，王 悦，刘新光，4，孙雪荣* （1.广东医科大学衰老研究所，广东东莞 523808；2.广东省医学分子诊断重点实验室，广东东莞 523808；3.广东医科大学东莞科研中心，广东东莞 523808;4.广东医科大学生物化学与分子生物学研究所，广东湛江 524023）

AHA1(activator of heat shock 90kDa protein ATPase homolog 1) 为Hsp90 的协调分子伴侣，对激活Hsp90的ATPase 的活性至关重要[1]。研究发现，Hsp90 在恶性黑色素瘤患者的血清及恶性黑色素瘤组织中的表达明显上调[2-3]，并且高表达的Hsp90 已经成为黑色素瘤一种重要的分子标记[4]。使用Hsp90 蛋白的抑制剂抑制肿瘤细胞的增殖时，AHA1 的表达量却持续上调[5]，表明AHA1 的表达可能也与肿瘤的发生发展相关。有研究发现，AHA1 在骨肉瘤细胞中呈高表达[6]，并且Aha1基因的表达可以调节骨肉瘤细胞的增殖和细胞周期[7]。我们前期的研究结果表明，Aha1基因的表达参与调节恶性黑色素瘤细胞的增殖与细胞周期[8]，但是Aha1基因在黑色素瘤的形成过程中的作用尚未明了。本研究旨在研究Aha1基因是否参与黑色素瘤的形成以及对黑色瘤细胞凋亡的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

B16F10 细胞购自中国科学院上海细胞库，无特定病原体(SPF)级C57BL/6 小鼠购自中山大学实验中心。细胞培养基DMEM 和血清FBS 购自Gibco 公司。pCMV-HA 与pCMV-HA-AHA1 真核表达载体为本实验室前期自行构建的质粒。TRIzol 和LipofectamineTM3000 购 自Invitrogen 公司，PrimeScript Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit 逆转录试剂盒购自TaKaRa 公司，荧光定量PCR 试剂TransStart Green qPCR SuperMix购自北京全式金生物。RIPA 裂解液购自北京索莱宝公司，蛋白酶抑制剂Cocktail 购自Thermo Scientific 公司，BCA 蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天公司，甲叉双丙烯酰胺购自Bio-Rad 公司，TEMED、过硫酸铵、SDS购自Sigma 公司，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜购自Millipore 公司，ECL 试剂盒购自Pierce 公司。……