李铄，王茂叶，臧雪燕，蒋鹏程，许文荣，张徐(.江苏大学医学院&江苏省检验医学重点实验室，江苏镇江03；.江苏大学消化病研究所, 江苏镇江00)

胃癌是我国常见的消化系统恶性肿瘤之一[1]。尽管近年来胃癌的发病率有下降趋势，但早期胃癌缺乏特异性临床表现，许多患者确诊时已处于进展期，丧失了手术机会。内镜结合增强CT是目前诊断早期胃癌的金标准，但此法为有创操作，不易作为诊断和监测肿瘤进展的长期方法。血清学检测癌胚抗原CEA、糖类抗原CA-199等指标对早期胃癌的敏感性和特异性不高。因此，寻找新的诊断标志物和治疗策略尤为重要。

circRNA是一类新型的非编码RNA，于20世纪70年代科学家研究植物病毒时被发现。既往研究人员认为circRNA是前体mRNA加工过程中的副产物或者错误剪接的结果，不具有生物学意义，未引起足够重视。随着高通量RNA测序(RNA-seq)技术和生物信息学的发展，circRNA现已被证实广泛存在于各种生命体内，具有细胞信号传导、蛋白质翻译等重要的生物学功能，其异常表达影响着肺癌、肝癌及胃癌等多种肿瘤的发生、发展[2]。诸多研究[3-5]也已证实，circRNA可通过结合蛋白和作为miRNA的海绵吸附分子参与胃癌的发病过程，具有成为胃癌诊断、预后监测生物学标志物的潜能。本文分别从circRNA的结构功能、检测方法及其与胃癌的相关研究进展作一综述，以期对胃癌的诊断、疗效分析等提供参考。

1 circRNA

1.1circRNA的结构与生物学功能 circRNA是一种单链共价闭合环状的RNA。相比线性RNA，因其具有抵抗核酸外切酶的水解作用，故而稳定性更高。根据基因编码环化方式，circRNA可分为外显子circRNA(exonic circRNA，ecircRNA)、内含子circRNA(intronic circRNA，ciRNA)、外显子-内含子circRNA(exon-intron circular RNA，EIciRNA)以及基因间circRNA(intragenic circular，icircRNA)4大类[6]。circRNA具有许多潜在生物学功能，例如，(1)作为miRNA的海绵吸附分子：circRNA能起到竞争内源性RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)的功能，通过竞争具有结合位点的miRNA，阻滞miRNA对其靶基因的抑制作用，进而调控相关mRNA表达[7]。(2)结合相关蛋白质：在细胞核中某些circRNA能够与蛋白质结合，充当蛋白质的“分子诱饵”，影响下游靶基因表达[8]。(3)调节基因转录：ciRNA和EIciRNA可以通过与U1核内小核糖核蛋白(small nuclear ribo-nucleoproteins,snRNP)以及位于其亲本基因启动子上的RNA聚合酶Ⅱ(RNA-polⅡ)相互作用促进其亲本基因转录表达[9]。(4)翻译蛋白质：有学者在肝炎病毒中发现circRNA可直接翻译蛋白质[10]。2017年,Legnini等[11]发现，circ-ZNF609在内部核糖体进入位点序列(internal ribosome entry site,IRES)驱动下翻译小鼠成肌细胞中的蛋白质；Pamudurti等[12]发现,circMbl3可以翻译果蝇中的蛋白质。以上研究证实了circRNA新的功能，为今后circRNA的研究提供了新的方向。

1.2circRNA检测技术 随着对circRNA医学研究价值认识的深入，寻求快速、敏感、高效检测circRNA的方法愈发重要。目前常用检测circRNA的方法包括：(1)基因芯片技术(gene chip)：应用相对成熟的检测技术，通过将已知序列的分子探针固定在基片上，与标记的样本进行杂交，通过检测样本杂交信号的强弱及分布情况以确定RNA序列，其具有高通量、特异性高的特点，但相对“封闭”，只能检测已知的序列，无法检测未知的circRNA，使用成本较高。(2)逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)检测技术：逆转录获得cDNA，通过实时检测扩增产物的数量，最终达到间接定量检测circRNA的目的，该法广泛应用于基因芯片结果的验证以及circRNA在组织中表达水平的测定。但circRNA在体液中的含量极低，RT-PCR的敏感性无法满足circRNA的基因检测要求，此外，分析circRNA结果使用的2-△△Ct法需要人体内源性稳定表达的内参进行矫正，而目前缺乏相应的体液内参指标，限制了circRNA作为非侵入性诊断工具的应用。

鉴于上述检测方法的局限，有学者在其原理基础上进行改良，设计出针对外周体液中circRNA具有高敏感性的检测方法。微滴式数字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)是近年来对微量核酸表达进行快速、准确定量检测的技术[13]。通过将含有circRNA目的基因的样本进行微滴化预处理，使其形成纳米直径大小油包水的微滴，使单个微滴独立进行PCR反应，通过微滴检测器捕捉单个微滴的荧光信号，高于阈值的荧光信号判断为阳性信号，否则判为阴性信号。按照泊松分布原理，通过计算得出原始样本中circRNA浓度。ddPCR可准确得出目标核苷酸的浓度，适合对血清等体液中circRNA检测，目前主要应用于病毒和核酸类肿瘤标志物的检测。

为进一步提高检测的敏感性，研究人员基于不同原理设计出新的检测技术。例如，双链特异性核酸酶(duplex-specific nuclease，DSN)是一种从勘察加蟹的肝脏胰腺中分离提取的核酸酶，其能够对双链DNA和DNA-RNA杂交体中DNA链进行专一裂解，但对RNA和单链DNA几乎没有作用。Jiao等[14]利用DSN酶的这种特性实现对circRNA的快速精准检测。DSN酶介导的核酸酶诱导扩增反应是基于核酸酶水解作用形成的信号扩增技术，该方法直接在溶液中将DSN酶与circRNA混合进行快速检测，实验设计简单，敏感性高，不需要PCR扩增过程，相较PCR减少假阳性结果。具体机制见图1。

图1 DSN酶介导的核酸酶诱导扩增反应对circRNA的检测机制

滚环扩增(rolling circle amplification，RCA)技术由于其较高的扩增效率及相对简单的反应条件，受到众多研究者的关注，近年来广泛用于生命领域的检测。RCA反应体系中剪切酶在固定温度下保持活性，使得反应可在恒温条件完成，与PCR相比无需热循环过程进行扩增，可减少反应装置体积及成本。2019年，Liu等[15]在RCA反应原理基础上设计出逆转录-滚环扩增(reverse transcription-rolling circle amplification，RT-RCA)技术。其首先在反应体系中加入脱氧核糖核酸(dNTPs)、剪切酶、环状引物，让环状引物与circRNA结合，在ProtoScript Ⅱ逆转录酶作用下，以环状引物为模板催化dNTPs形成反复衔接的环形核酸单链。而线性RNA无法产生足够的重复序列，因此，可将circRNA与线性RNA进行鉴别，与传统方法相比，其具有操作简化、费用较低、敏感性高的特点。具体机制见图2。

图2 RT-RCA对circRNA的检测机制

目前对于circRNA的功能研究还在不断深入，创新的检测方法对于促进circRNA的研究具有重要的作用。circRNA由于其丰度低、特异性不高，在高效检测方面仍面临许多困难。目前对于circRNA检测的研究主要聚焦于如何提高检测敏感性，降低检测成本以及简化操作等方面，未来便携、灵敏、经济、高通量、具有足够特异性的检测技术是最终发展的趋势。表1将常见circRNA的检测技术进行对比，根据检验目的并结合相关检测技术特点，选择经济合理的检测方法。

表1 circRNA的检测技术

2 circRNA与胃癌

2.1circRNA在胃癌中发生、发展的作用

2.1.1具有致癌作用的circRNA RNA测序分析表明，circRNA在胃癌组织中高度特异性表达，其表达水平与胃癌的恶性生物学行为有密切关系[16]。Zhang等[17]采用qRT-PCR证实circNRIP1在胃癌细胞中相对正常胃黏膜上皮细胞呈过量表达(P<0.001)，circNRIP1可通过结合miR-149-5p激活AKT1/mTOR信号通路，提示其与胃癌的增殖、侵袭和迁移相关。另一项研究发现[18]，circPDSS1通过负调控miR-186-5p在体内外促进肿瘤细胞的增殖及侵袭，该负调控导致有丝分裂相关激酶2(never in mitosis gene A-related expressed kinase2，NEK2)的表达水平升高，影响DNA损伤和衰老调控机制。Zhu等[19]研究发现，circNHSL1与结合波形蛋白(vimentin，VIM)在胃癌组织中均呈高表达。大量研究证实，VIM与多种肿瘤的发展密切相关，通过进一步研究发现,circNHSL1与VIM之间存在靶向关系，circNHSL1结合miR-1306-3p使得同源异型盒基因(sine oculis homeobox homolog1，Six1)表达增强，产物Six1转录因子通过结合VIM启动子区域，增强VIM表达，促进胃癌细胞的增殖。

2.1.2具有抑癌作用的circRNA Liu等[20]发现，相较癌旁组织，circ0002320在胃癌组织中呈低表达(P<0.001)，其进一步采用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)检测结果显示，circ-0002320和miR-367-5p共同在细胞质中定位，circ-0002320过表达上调细胞周期蛋白激酶抑制因子(p27 Kip1)在胃癌细胞中的表达，并抑制胃癌生长和侵袭。Zhang等[21]通过RNA数据库进行生物信息学预测，circRNA表达谱数据分析以及RNA免疫沉淀技术验证，推导出源自LARP4基因位点的circLARP4海绵吸附miR-424，其高表达抑制胃癌细胞增殖、侵袭。目前仍有大量的circRNA尚未发现，其影响胃癌生物学行为的具体机制仍需探索。涉及与胃癌调控相关circRNA见表2。

表2 调控胃癌相关的circRNA

2.2circRNA作为早期胃癌潜在诊断标志物 circRNA的特殊结构使其能在外周体液及组织中稳定存在，方便取样检测；此外circRNA在正常组织及肿瘤组织中的表达存在显著差异，具有较高的特异性及敏感性，与肿瘤的发生、发展有较高的关联性，这些特点使其具备作为非侵入性诊断标志物的条件。研究表明，circRNA具有临床疾病早期诊断的潜在价值[23]。Wei等[24]研究发现，hsa_circRNA_102958在30例健康人对照者组织中的表达水平显著低于胃癌患者，其作为诊断标志物的ROC曲线下面积(area under curve，AUCROC)为0.74，敏感性及特异性分别为0.61和0.86，表明hsa_circRNA_102958具有一定诊断价值。Zhao等[25]通过qRT-PCR检测发现，hsa_circ_0000181在胃癌患者组织和血清中相对健康人呈低表达，且组织样本的特异性为0.852，明显高于血清样本的0.206，而胃癌患者血清标本的敏感性为0.990，显著高于组织标本的0.539，表明血清中的circRNA相较于组织作为早期胃癌潜在诊断标志物具有一定的优势。

为进一步提高circRNA诊断早期胃癌的敏感性及特异性，有学者将几种具有诊断价值的circRNA进行组合分析。例如，Li等[26]研究发现，hsa_circ_0061276和hsa_circ_0001017在胃癌患者血浆和组织中均呈低表达，其AUCROC分别为0.851和0.849，但将这2种标志物联合分析，其AUCROC提高至0.912。表明与胃癌相关circRNA进行组合分析，其诊断精确度较单项结果更高。与胃癌诊断相关的circRNA见表3。

表3 与胃癌诊断和预后相关circRNA

2.3circRNA作为胃癌预后辅助标志物 胃癌具有易转移、易复发、预后差的特点，寻找相关准确判断胃癌患者预后的生物学指标，对于胃癌患者的临床精准化治疗具有重要意义。circRNA通过多种调控信号通路影响胃癌的发生、发展，调节胃癌细胞的迁移、侵袭、增殖和凋亡能力，目前已发现多种circRNA与胃癌的预后相关。Rong等[27]研究发现，circPSMC3在胃癌组织中下调，其进一步分析106例胃癌患者circPSMC3的表达水平并结合临床病理资料，结果发现circPSMC3表达降低患者存在TNM分期升高、总生存期(overall survival，OS)缩短等现象，其鉴别诊断胃癌的AUCROC为0.93(95%CI：0.886～0.979，P<0.001)，当cut-off值为9.965时，其敏感性及特异性分别为0.85、0.95，表明circPSMC3可作为独立预测患者预后的指标。Pan等[28]通过对108例胃癌患者临床病理资料分析发现，circUBA1在胃癌组织中显著高表达，其高表达与肿瘤体积、TNM分期相关；进一步进行多元生存分析发现，高表达circUBA1患者的生存预后明显较差(16.7% vs 45.6%,P<0.001)。Wei等[29]研究表明，circHIPK3在胃癌细胞系及组织中表达显著上调，通过circHIPK3/miR-107/BDNF通路调控胃癌进展，circHIPK3表达升高与胃癌患者预后不良显著相关，有望成为胃癌预后判断的良好检测指标。

3 外泌体来源的circRNA与胃癌

外泌体是具有双膜结构的微小囊泡，可由体内多种细胞(包括肿瘤细胞)分泌释放，通过在细胞间传递生物活性分子进行生物信息交换并使受体细胞重新编程，源自肿瘤细胞的外泌体携带(包括circRNA等)囊泡内的生物分子释放给其他受体细胞，促进肿瘤的发生和转移[30]。研究发现，胃癌细胞以外泌体形式将cikS-133递送至前脂肪细胞，通过激活结构域蛋白16(PR domain-containing 16, PRDM16)和抑制miR-133,以促进前脂肪细胞向棕色样细胞的分化，在胃癌相关恶病质中发挥关键作用[31]。Xie等[32]研究发现，高表达外泌体circSHKBP1与胃癌患者预后不良相关，而手术治疗后的胃癌患者体内外泌体circSHKBP1水平普遍下降，其进一步研究显示，其通过抑制miR-582-3p使RNA结合蛋白(HUR)和血管内皮生长因子(VEGF)呈高表达，从而促进血管生成和诱导肿瘤发展。此外，外泌体circSHKBP1与辅助伴侣蛋白STUB1竞争性地与热休克蛋白90(heat shock protein 90，HSP90)结合，防止HSP90泛素化，共同促进胃癌细胞增殖。外泌体的脂质双分子层囊泡能够保护内容物不受核酸酶等微环境因素影响，有利于其在外周体液中循环流动，参与肿瘤的发生、发展，其作为circRNA的“天然运输工具”为早期胃癌的诊治提供一种新的思路。

4 小结及展望

circRNA作为miRNA海绵，抑制其功能，可影响下游多种信号通路调控相关癌基因的表达，促进胃癌的发生、发展。circRNA的特殊结构使其具备易获取、敏感性高、特异性强、不易降解的特点，相较传统检测物更具优势，更加符合作为胃癌早期诊断、预后评估生物学标志物的标准。但目前有关circRNA仅限于理论研究，缺乏进一步的临床应用。究其原因主要包括：(1)已知的circRNA大部分在多种肿瘤中均有表达，缺乏在特定肿瘤中特异性表达而在其他肿瘤中正常表达的circRNA，无法做到精准检测的要求；(2)分析检测circRNA技术虽有发展，但仍无法满足大规模检测要求，限制了其在临床中的应用；(3)缺乏大规模、系统规范独立个体样本的验证，缺少高质量的临床数据应用支持。

目前关于circRNA的研究还处于初级阶段，存在大量circRNA的功能尚不可知以及在肿瘤中具体作用机制仍不清楚等问题，但circRNA自身初步展现的生物学特性使其在未来肿瘤领域具有巨大的研究价值。此外，仍需要加强circRNA的基础研究成果向临床应用方面的转化，以期尽早实现对肿瘤的精准化诊治。