常永莉，张莉媛，王惠琴，王冰，陈方园，李天浩(陕西中医药大学第二附属医院呼吸内科，陕西咸阳 712000)

细胞因子可调节细胞增殖、分化，其中白细胞介素-13(interleukin-13,IL-13)基因、β2肾上腺素能受体(β2 adrenergic receptor,β2-AR)基因、人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)基因在哮喘患者发病过程中具有重要意义[1]。IL-13基因Intron3+1923位点C/T多态性对IL-13的生物学活性具有调节作用[2]。Mohamed-Hussein等[3]指出，β2-AR功能低下可能是导致哮喘发病的重要机制。谷亚星等[4]认为，HLA基因在调节机体免疫方面具有重要作用，且对多种呼吸系统疾病具有易感性。因此，对上述基因多态性的研究已成为了哮喘遗传学的研究热点。本研究采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法(PCR-PFLP)对90例哮喘患者IL-13、β2-AR及HLA基因进行检测，并测定其与T淋巴细胞亚群及免疫球蛋白E(IgE)之间的关系。

1 资料与方法

1.2仪器与试剂 限制性内切酶NIAⅣ、TaqDNA聚合酶、IgE酶标抗体、Trizol试剂(美国赛默飞世尔科技公司)，抗人CD3+、CD4+、CD8+单克隆抗体及IgG对照(北京同立海源生物科技公司)。Applied biosystems PCR热循环仪(美国赛默飞世尔科技公司)，DNM-9602G酶联仪(北京普朗新技术公司)，DYY-4C稳压稳流定时电泳仪(上海沪粤明科学仪器公司)，BD流式细胞仪(昆山市赛特科学仪器公司)。

1.3方法

1.3.1标本采集及DNA抽提 采集哮喘患者治疗前及健康人对照组体检时的晨起空腹静脉血3 mL，477×g离心10 min。取血浆500 μL，置于-20 ℃保存，用以检测血清IgE水平。其余部分抽提DNA。吸取细胞悬液至1.5 mL Ep管中，4 ℃、251×g离心5 min，弃上清液，按照Trizol试剂说明书操作抽提DNA，采用紫外分光光度计检测DNA样本，取吸光度(A260/280 nm)值在1.8～2.1的样本用于后续试验。样本置-20 ℃保存。

1.3.2引物设计及PCR 根据GenBank收录的IL-13、β2-AR、HLA基因序列，采用Primer Premier 5.0软件设计引物，并由上海生工公司合成特异性引物，引物序列见表1。PCR扩增总体系为50 μL，包括基因组DNA 200 ng，10×PCR buffer 5 μL，dNTPs各10 nmol，1. 5 U Taq DNA 聚合酶，10 pmol上、下游引物，具体扩增所需MgCl2浓度(IL-13和β2-ARR16G A/G均为1.5 μL，HLA为2.0 μL)，使用灭菌蒸馏水补充体积至50 μL。IL-13基因PCR循环参数：94 ℃ 变性2 min；94 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 50 s，共35个循环；72 ℃延伸 5 min。β2-ARR16G A/G基因PCR循环参数：95 ℃变性5 min；95 ℃ 30 s，66 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，共40个循环；72 ℃ 10 min。HLA基因PCR循环参数：94 ℃变性 5 min；55 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，共35个循环；72 ℃ 10 min。取3 μL PCR扩增产物，采用Applied biosystems PCR热循环仪检测(220 V电压，电泳20 min)，30 g/L琼脂糖凝胶电泳并观察。

表1 PCR引物序列及产物片段大小

1.3.3PCR-PFLP 取PCR产物10 μL，37 ℃酶切过夜。在30 g/L琼脂糖凝胶中加溴化乙锭(0.7 mg/L)，取8 μL酶切产物上样电泳凝胶，紫外分光光度计下观察。IL-13基因型CC位点存在BsaAI位点，酶切产物为310 bp、249 bp，CT基因型出现酶切点，酶切产物为559 bp、310 bp、249 bp，而TT基因未出现酶切点。β2-ARR16G基因酶切后A/A基因型为168 bp，G/G基因型为150 bp+18 bp，A/G杂合子基因型为168 bp+150 bp+18 bp。

1.3.4流式细胞术检测T淋巴细胞亚群 取各组患者静脉血3 mL，经EDTA-K2抗凝后，取100 μL加入试管，依次加入抗人CD3+、CD4+、CD8+单克隆抗体20 μL，取另一管加入MsIgG1-RD1/MsIgG2-FITC各20 μL作为阴性对照管，避光静置30 min。加入0.2 mL溶血剂后进行10倍稀释，静置5 min，240×g离心5 min后弃上清液。加入2 mL PBS洗涤2次，240×g离心5 min。加入1%多聚甲醛0.3 mL，采用BD流式细胞仪检测。以CD3+、CD4+、CD8+阳性率≥0.1%为阳性表达。

1.3.5ELISA法检测血清IgE 取上述2组患者的血清样本，复温后按照ELISA试剂盒及DNM-9602G酶联仪说明书操作检测IgE水平。IgE参考范围<85 KU/L。

2 结果

2.1IL-13、β2-AR、HLA基因频率在2组中的分布 疾病组患者IL-13基因Intron3+1923位点TT、TC基因型频率、β2-ARR16G基因位点AA基因型频率、HLA基因0401、0601等位基因频率较健康人对照组均显著升高(P<0.05)。而IL-13基因Intron3+1923位点CC基因型频率较健康人对照组显著降低(P<0.05)。见表2。

表2 2组IL-13、β2-AR、HLA基因不同基因型频率[n(%)]

2.2IL-13、β2-AR、HLA不同基因型对T淋巴细胞亚群及血清IgE水平的影响IL-13TT、TC，β2-ARAA，HLA0401、0601基因型患者CD3+、CD4+、CD4+/CD8+较IL-13CC，β2-ARGG、AG，HLA0101/0102、0103、0501基因型患者显著降低，而血清IgE水平较IL-13CC、GG，β2-ARAG，HLA0101/0102、0103、0501基因型显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 IL-13基因不同基因型患者T淋巴细胞及IgE的水平

3 讨论

既往的研究仅针对单一基因位点进行相关性分析，对多个基因位点研究报道较少，考虑到IL-13、β2-AR、HLA基因多态性在哮喘患者进展过程中具有重要的临床意义，本研究使用PCR-PFLP法进行基因多态性分析，并对其与患者T淋巴细胞亚群及IgE水平关系进行探讨。

本研究结果显示，哮喘患者IL-13基因Intron3+1923位点共出现CC、TT、TC 3种基因型，其中患者TT、TC基因型频率显著高于健康人对照组(P<0.05)，表明哮喘患者T等位基因频率分布高于健康人对照组，C等位基因显著低于健康人对照组，提示IL-13基因Intron3+1923位点上的T等位基因可能是哮喘的易感基因，而C等位基因可能是哮喘患者的抵抗基因。因此，具有T等位基因的人群可能因为长期生活在污染严重或过敏原较多的环境中，哮喘发病率明显增加[6]。此外，β2-ARR16G单核苷酸多态性(SNP)共出现AA、GG、AG 3种基因型，AA基因型频率高于健康人对照组(P<0.05)。AA属纯合子基因型，提示纯合子基因型与哮喘发作有一定关联。刘晓华等[7]研究证实，β2-ARR16G中AA基因型与哮喘具有一定相关性，急性期和缓解期β2-ARR16G 16位点的分布基因频率中精氨酸/精氨酸分别为17.7%和23.5%，精氨酸/甘氨酸为67.7%和66.2%，甘氨酸/甘氨酸为14.5%和10.3%，27位点分布基因频率中谷氨酰胺/谷氨酰胺为80.6%和75.0%，谷氨酰胺/谷氨酸为12.9%和17.6%，谷氨酸/谷氨酸为6.5%和7.4%，二者在2个位点上基因型存在差异，与本研究结果相一致。HLA等位基因共出现0101/0102、0103、0401、0601、0501基因型，HLA0401、0601基因型频率均高于健康人对照组(P<0.05)，提示0401、0601基因型可对哮喘产生影响。有学者证实，IL-13水平过高可诱导患者体内B细胞合成IgE，导致患者出现免疫功能紊乱，出现T淋巴细胞亚群失衡[8]。本研究中TT、TC、AA、0401、0601型患者CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平均低于其余基因型患者，而血清IgE水平高于其余基因型患者，提示IL-13基因携带T基因型、β2-AR基因AA纯合子基因型、HLA0401、0601等位基因可能具有协同作用。

通过研究IL-13、β2-AR、HLA基因位点突变导致哮喘进展，引起T淋巴细胞亚群、IgE表达失衡，笔者认为IL-13、β2-AR、HLA基因表达水平异常及基因多态性可导致机体出现TH1/TH2失衡，IL-13表达水平增加，大量作用于B细胞，从而加重体内炎症反应。Reich等[9]指出，IgE可调节严重特应性皮炎患者皮肤组织中IL-13的表达，与本研究结果相一致。同时，IL-13基因可直接促进IgE细胞因子合成，β2-AR、HLA基因可转导相似信号[10]。虽然β2-AR、HLA基因与IL-13之间的作用机理目前尚不清楚，但IL-13可诱导MHC Ⅱ类分子及CD23表达，抑制嗜酸性粒细胞凋亡，诱导β2-AR及HLA-DR表达，促进T细胞活化。本研究仅证实IL-13基因携带T基因型、β2-AR基因AA纯合子基因型、HLA0401、0601等位基因与哮喘患者存在一定关系，但在地域、人种之间的区别及如何形成遗传易感性机制，还需进一步研究。本研究今后将增加样本量，并对患者病情严重程度及家族史进行分析，从而为预防、诊治哮喘提供实验依据。