田亚萍，张明威，葛京平，张春妮，汪俊军，王成(1.常州市第一人民医院检验科，江苏常州 213003；2.中国人民解放军东部战区总医院 a.检验科，b.泌尿外科，南京 210002)

肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)是肾脏常见的恶性肿瘤，且易对放、化疗耐受，目前手术切除仍是首要治疗方案。ccRCC尚缺乏有效的血清学标志物，病理活检是ccRCC诊断的“金标准”，但因具有创伤性使其临床应用受限[1]。目前已证实几种血清蛋白质具有一定的诊断ccRCC或提示复发的价值，但其临床应用价值尚不明确[2]。细胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)是细胞主动分泌的30～150 nm的囊泡，可携带miRNAs等生物活性分子在细胞组织间传递交流。因EVs miRNAs的释放是一个主动过程，其作为肿瘤分子生物学标志物更具特异性[3]。miR-99b-3p在多种不同类型肿瘤中表达异常，而与其源于同一前体miRNA的miR-99b-5p，在ccRCC患者组织中呈低表达，且与酪氨酸激酶抑制剂治疗的肿瘤进展有关[4]，提示miR-99b-3p亦可能与ccRCC密切相关。本研究拟通过检测miR-99b-3p在ccRCC患者和健康人对照血清EVs中的表达水平，评估其作为辅助诊断ccRCC的潜在临床价值。

1 材料与方法

1.1研究对象 收集2016年12月至2018年10月于东部战区总医院泌尿外科初诊且确诊为肾脏疾病患者的血清样本100例。排除标准：(1)ccRCC伴有乙肝、结核、急性炎症、肾肿瘤未确诊或其他器官肿瘤；(2)接受过干预治疗的ccRCC、ccRCC复发或最后被确诊为非肾脏恶性肿瘤，如肾囊肿、肾良性肿瘤；(3)肾脏其他恶性肿瘤，如多房囊性肾细胞癌、嫌色肾细胞癌、乳头状肾细胞癌、Xp11.2易位/转录因子E3(translocation facor E3，TFE3)基因融合相关性肾细胞癌。参照WHO肿瘤分型标准对所有患者手术切除样本进行病理学确诊，最终共有65例ccRCC患者样本纳入分析，且在入院之前均未进行任何治疗，其中男37例，女28例，年龄(57.31±1.33)岁。按照Furhman分级标准[5]对肿瘤进行分级，其中Ⅰ级(高分化)5例、Ⅱ级(高分化)47例、Ⅲ级(中分化)10例、Ⅳ级(低分化)3例。75名健康人对照为同期在本院体检中心就诊的体检者，男43例，女32例，年龄(56.54±1.55)岁，两组间性别(χ2=0.002，P>0.05)、年龄(t=0.380，P>0.05)差异均无统计学意义。本研究经东部战区总医院医学伦理委员会批准(No.2017NZGKJ-068)，纳入对象均知情同意。

1.2主要试剂与仪器 分析纯级别无水乙醇、异丙醇、氯仿(上海化学试剂公司)，ExoQuick-exosome试剂盒(美国CA公司)，AMV逆转录酶、rTaq酶、buffer、dNTP及MgCl2等均购自日本TaKaRa公司，除RNA酶水(美国Sigma-Aldrich公司)，Trizol试剂(美国Life Technologies公司)，miR-99b-3p及内参miR-16所用逆转录引物、TaqMan探针、7300型实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)，Tissuelyser-48全自动样品自动研磨仪(上海净信科技公司)，SAS67120型超纯水机(美国Millipore公司)，5418型高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)。

1.3标本前期处理与保存 抽取健康人对照体检时和ccRCC患者治疗前的空腹静脉血3.5 mL于含分离胶的生化管中。1 500×g离心5 min后取血清，4 ℃、12 000×g离心5 min，进一步去除残留血细胞和细胞碎片，将收集上清置于-80 ℃保存。

1.4血清EVs的提取 按照ExoQuick试剂盒操作说明书提取100 μL血清中EVs，并将其重悬于25 μL除RNA酶水中。

1.5EVs RNA提取 用Trizol试剂从EVs重悬液中提取RNA[6]，所得总RNA溶解于20 μL除RNA酶水后，置于-80 ℃保存待用。

1.6qRT-PCR检测EVs miR-99b-3p水平 用基于TaqMan探针技术的qRT-PCR检测EVs miR-99b-3p。首先将RNA逆转录为cDNA，逆转录反应体系：3.5 μL DEPC ddH2O、2 μL 5×buffer、1 μL反向引物、0.5 μL AMV酶、2 μL RNA和1 μL 10 mmol/L dNTPs，共10 μL，反应条件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，4 ℃保存，将所得cDNA样本置于-20 ℃保存。qRT-PCR反应体系共20 μL，包括： 14.77 μL ddH2O、2 μL 10×PCR缓冲液、1.2 μL 25 mmol/L MgCl2、0.4 μL 10 mmol/L dNTP、0.3 μL rTaq酶、0.33 μL TaqMan探针和miRNA上、下游引物、1 μL cDNA。反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40个循环。另外，以无RNA模板的ddH2O为阴性对照，每份样本均进行3个复孔检测。采用内参基因miR-16对结果进行校正以及计算EVs miR-99b-3p的表达水平；应用2-△Ct法[7]计算EVs miR-99b-3p相对于内参miR-16的表达水平，公式：△Ct=CtmiR-99b-3p-CtmiR-16。

2 结果

2.1ccRCC患者EVs miR-99b-3p水平变化 miR-16在ccRCC患者和健康人对照血清EVs中的表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。进一步利用miR-16对miR-99b-3p的水平进行校正和计算。qRT-PCR检测结果显示，ccRCC患者血清EVs miR-99b-3p水平[19.770(4.724，22.910)]显著高于健康人对照组[5.830(2.046，7.862)]，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.2ccRCC早期患者EVs miR-99b-3p变化水平 Ⅰ/Ⅱ级ccRCC(早期)患者的EVs miR-99b-3p水平[16.960(4.429，20.960)]和Ⅲ/Ⅳ级ccRCC患者(晚期)的EVs miR-99b-3p水平[27.490(5.248，37.060)]均显著高于体检健康者(P均<0.01)；但早期与晚期ccRCC患者EVs miR-99b-3p水平间的差异则无统计学意义(P>0.05)。

2.3ROC曲线评估EVs miR-99b-3p水平筛查ccRCC的效能 将ccRCC患者和健康人对照分别设为疾病组和对照组，绘制ROC曲线。根据Youden指数最大原则，确定cut-off值，并计算其RCC曲线下面积(AUCROC)、敏感性、特异性，评估EVs miR-99b-3p对于ccRCC的筛查价值，结果显示，当取cut-off值6.483时，其筛查ccRCC患者与健康人对照的AUCROC为0.757(95%CI：0.674～0.840)；筛查早期ccRCC患者与健康人对照的AUCROC为0.754(95%CI：0.663～0.846)，筛查ccRCC及早期ccRCC的敏感性均为69.2%，特异性均为77.3%，但早、晚期ccRCC患者EVs miR-99b-3p水平差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

注：A，EVs miR-99b-3p对ccRCC筛查价值；B，EVs miR-99b-3p对早期ccRCC筛查价值。

2.4EVs miR-99b-3p水平与ccRCC的风险评估分析 在单因素Logistic回归分析中，将ccRCC状态作为因变量，EVs miR-99b-3p为自变量，结果显示EVs miR-99b-3p与ccRCC密切相关(OR=7.677，95%CI：3.610～16.328，P<0.01)；校正性别、年龄、饮酒史及吸烟史等因素后，多因素Logistic回归分析结果显示，EVs miR-99b-3p仍是ccRCC患者潜在的独立危险因素(OR=7.745，95%CI：3.596～16.682，P<0.01)。

2.5EVs miR-99b-3p水平与ccRCC患者临床病理参数的相关分析 Pearson相关分析结果显示，EVs miR-99b-3p与ccRCC患者的临床分级、肿瘤大小、有无远处转移均无明确相关性(r值分别为0.018、-0.152、0.020，P均>0.05)。

3 讨论

EVs miRNA与ccRCC的关系已有相关报道。ccRCC患者尿液EVs中的miR-126-3p、miR-449a以及miR-34b-5p可作为ccRCC潜在的非侵入性诊断性尿液生物标志物[8]。Dias等[9]分析来自32例ccRCC原位癌患者手术前后及37例伴随转移的ccRCC患者血浆EVs miRNA图谱，结果发现，与术前相比，术后EVs hsa-miR-25-3p、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-200c-3p和hsa-miR-301a-3p的水平降低，而hsa-miR-1293水平升高；与原位癌患者相比，已发生转移患者的hsa-miR-301a-3p水平升高，而hsa-miR-1293水平降低，提示hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-1293可作为转移性ccRCC的肿瘤标志物。

本研究通过qRT-PCR检测miR-99b-3p在ccRCC患者血清EVs中的表达水平，发现相比于健康人对照，ccRCC患者血清EVs miR-99b-3p显著升高。ROC曲线分析提示，血清EVs miR-99b-3p对ccRCC的诊断有潜在应用价值，但对早期患者尚不具备更好的诊断效率。同时Logistics回归结果显示，miR-99b-3p是ccRCC的独立危险因子。然而，本研究尚存在一些不足：(1)样本量不够充足，已有数据无法证实EVs miR-99b-3p与ccRCC的临床分期、肿瘤大小、是否发生转移相关；(2)EVs miR-99b-3p的具体来源、去向及分子调控机制并不清楚，对其调控的靶基因以及生物学功能还需进一步研究；(3)患者随访时间较短，无法评估EVs miR-99b-3p对ccRCC预后价值；(4)ccRCC组织中miR-99b-3p的表达水平如何，是否与EVs表达一致尚不清楚。后期我们将扩大样本量并加强随访以及增加组织样本进一步探讨。

miR-99b在多种不同类型肿瘤中发挥不同作用，如miR-99b通过抑制κB-Ras2和mTOR基因的表达，促进肿瘤相关巨噬细胞的吞噬作用和抗原呈递能力，但具体调控机制尚不明确[10]；Li等[11]发现，miR-99b可抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路，抑制人宫颈癌细胞的侵袭和转移，并证实其以与mRNA 3′-UTR结合方式下调mTOR的表达。另外，Yao等[12]通过体外细胞实验证实miR-99b-3p通过直接靶向原钙黏蛋白19，促进肝癌细胞转移和增殖，其调控机制也是在转录后水平与原钙黏蛋白19 mRNA结合，且高表达的miR-99b-3p与肝癌患者的恶性临床病理特征和较差的预后密切相关。由于miR-99b-3p和miR-99b-5p由同一前体经核酸内切酶处理而来，据此猜测miR-99b-3p亦可能与ccRCC的进展密切相关。本研究结果表明，miR-99b-3p在ccRCC患者血清中EVs表达水平升高，且对ccRCC具有潜在的诊断价值，但对其潜在的靶基因、其对靶基因的调控是经典的转录后水平或通过其他方式进行调控，以及如何影响ccRCC的生物学行为仍需进一步研究。